葛根芩连汤治疗对2型糖尿病湿热证肠道菌群影响

曾艺鹏，冯新格，谷成英，郭亚芳，许迎烈

（复旦大学附属浦东医院/上海市浦东医院，上海 浦东新区 201399）

葛根芩连汤治疗对2型糖尿病湿热证肠道菌群影响

曾艺鹏，冯新格，谷成英，郭亚芳，许迎烈

（复旦大学附属浦东医院/上海市浦东医院，上海 浦东新区 201399）

目的：观察葛根芩连汤治疗2型糖尿病湿热证的疗效及对患者肠道菌群的影响。方法：将42例2型糖尿病湿热证患者随机分两组，对照组使用单纯西药治疗，中药组在西药治疗的基础上联用葛根芩连汤。采用Illumina Miseq高通量测序技术对患者粪便样本中所有细菌的16S rRNA－V3区进行DNA测序，通过实时定量PCR对肠道菌群进行定量分析。对比观察两组患者治疗前后疗效与肠道菌群的关系。结果：中药组总有效率高于对照组，差异具有统计学意义（p＝0.02)。湿热证减分率和Bacteroides含量成负相关；湿热证减分率和Fusobacterium含量呈正相关。结论：葛根芩连汤联合西药可有效治疗湿热证2型糖尿病，Bacteroides和Fusobacterium含量变化可作为疗效观察的标志物。

湿热证； 2型糖尿病； 肠道菌群； 葛根芩连汤

为探索中药治疗2型糖尿病的机制提供了新的视野，我们将在前期研究[1]的基础上，拟通过对2型糖尿病肠道菌群的高通量测序，分析湿热与肠道菌群的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料：于2015年1月至2015年12月间，随机选择42例经本院门诊及住院诊治为2型糖尿病伴湿热证型患者作为研究对象，均符合1999年WHO糖尿病诊断标准，且中医辨证为湿热证[2]。排除标准：排除年龄＜18岁，肠道器质性疾病者，严重心、肝、肾等病变患者，腹部手术史者，怀孕期或哺乳期者，近两周内使用过膨胀剂、止泻药、解痉药、益生菌及抗生素等药物。将研究对象利用SPSS软件随机分组程序分两组：中药组21例，男性9例，女性12例，平均年龄（38± 6.87）岁，BMI指数（28.03±3.23）kg/m2，病程（4.56±1.52）年；对照组21例，男性10例，女性11例，平均年龄（40.02±7.23）岁，BMI指数（29.11±3.94）kg/m2，病程（4.32±1.61）年。两组一般资料及湿热证候积分比较差异均无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 治疗方案：对两组患者进行糖尿病健康教育知识普及以及运动方面的指导，并在治疗的过程中严格控制患者的饮食。其中对照组的患者给予阿卡波糖、二甲双胍、瑞格列奈、格列美脲、吡格列酮等口服降糖药进行治疗。中药组患者在服用对照组口服药物的基础上，加用葛根芩连汤加减（葛根20g、黄芩9g、甘草6g、黄连12g。加减：阴虚热盛者合用白虎汤；气阴两虚者合用生脉饮；舌苔黄腻者加生薏苡仁、六一散；形体肥胖、脘腹胀满、不欲饮食，心下痞者合平胃散）。每次100mL，每天2次；连续用药2周为一疗程，观察1个疗程。

1.3 16S rRNA－V3区的PCR扩增及测序：无菌条件下获取自然排出的新鲜粪便（10±5）g，放入无菌冻存管后立即速冻，采样程序符合医院伦理要求。送至实验室提取DNA，粪便样本－80℃保存。用提取的总DNA作为模板，16S PCR引物由测序接头引物、Index 和V3区引物3部分组成。Index为6bp核苷酸随机组成的序列，以标记PCR产物的来源。PCR扩增体系采用25μL：2×Master Mix（NEB，美国）12.5μL，引物各1.5μL，模板2.5μL，灭菌双蒸水7μL（如模板DNA浓度较低则不加灭菌双蒸水，加等体积的模板）。扩增条件：98℃预变性30s，98℃10s，50℃30s，72℃30s，20个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。反应结束后将全部反应产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳（溴化乙锭染色）检测扩增片段大小，采用QIAquick Gel Extraction Kit（QIAGEN，德国）对目的条带胶回收纯化。将纯化后的16SrRNA－V3区的PCR产物送至进行测序，测序平台为Illumina Miseq。

1.4 实时荧光定量PCR：采用ABI实时定量PCR仪器对 Bacteroides F：GAGAGGAAGGTCCCCCAC，R：CGCTACTTGGCTGGTTCAG；Fusobacterium F：CCCTTCAGTGCCGCAGT；R：GTCGCAGGATGTCAAGAC分别进行定量检测。PCR均采用25μl反应体系，包括2 ×PCR Mix，2U Taq DNA聚合酶，0.2mmoL/L dNTP，正反向引物各0.1μmoL/L以及5μl DNA模板。反应程序为95℃ 1min，95℃ 25s，59℃ 30s，72℃ 20s，40个循环。荧光定量反应均以浓度101～108拷贝/μl的标准菌种16S rRNA基因片段的质粒DNA构建标准曲线，用每克粪便16S rRNA基因拷贝数的对数值表示两个组别所有个体细菌数量。样品定量数据经log10转换后录入SPSS17.0统计软件进行分析。

1.5 观察指标：中医证候积分评定按中医症状分级标准（半定量积分法）。增加脘腹胀满、恶心呕吐、口有秽臭、舌红苔黄腻、脉滑数等湿热证候积分项。证候积分评定分湿热证候积分，非湿热证候积分。湿热证候计分标准：阴性计0分，轻度计2分，中度计4分，重度计6分，舌红计2分，苔黄腻计2分，脉滑数计2分（舌脉计分，分0和2分2个等级）。

1.6 疗效评定标准[3]：显效：患者在治疗后的中医症状、体征有明显的改善，且证候积分减少70％以上；有效：患者的中医临床症状、体征有明显好转，且证候积分减少30％以上；无效：患者的中医临床症状、体征无明显的改善甚至加重，且中医证候积分减少小于30％。总有效率（％）＝（显效例数＋有效例数）/患者例数×100％。补充总有效率计算方法

1.7 统计学分析：本实验所有数据运用SPSS17.0统计分析软件进行统计分析。计数资料以率表示，进行卡方检验，UniFrac analysis进行肠道菌群主成分分析，Spearman秩相关进行变量间相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

表1 两组患者显效率及总有效率比较

2.1 两组临床疗效比较：两组治疗过程中均无明显不良反应；治疗后，中药组患者的症状改善，显效及总有效两组差异具有统计学意义（P值分别是0.04和0.02），见表1。

2.2 两组治疗前肠道菌群结构分析：PLS－DA图形分析可以有效的对组间观察值进行区分，找到导致组间区别的影响变量。入组前对两组（C组：对照组；D组：中药组）研究对象肠道菌群通过V3 16S rRNA进行深度测序，两组研究对象肠道菌群组间样本交错分散分布，未显示出肠道菌群的组间差别，如图1所示。多样本相似度树状图是利用树枝结构描述和比较呈现多个样本间的相似性和差异关系，样本之间的差异越小，样本便会处在相近的同一分支上。同样，在图2显示入组前对两组研究对象肠道菌群未出现明显组间差异。

图1 PLS－DA图形分析

图2 相似度树状图

2.3 肠道菌群与治疗后湿热证评分减分率的Spearman秩相关分析：治疗后，中药组Bacteroides含量与湿热评分减分率成负相关（R＝－0.57，P＜0.001）（图3A），Fusobacterium含量与湿热评分减分率成正相关（R＝0.58，p＝0.01）（图3B）；而对照组Bacteroides和Fusobacterium含量与湿热评分减分率均没有相关性，相关系数和P值分别是（R＝－0.06，p＝0.79）（图3C）和（R＝0.35，p＝0.12）（图3D）。

图3 湿热评分减分率和Bacteroides与Fusobacterium含量的相关性

3 讨 论

2型糖尿病是一种以胰岛素抵抗和慢性炎症为主要特征的代谢性疾病，其各种并发症相互关联相互影响[3]，我们前期的研究发现葛根芩连汤联合胰岛素治疗2型糖尿病，不仅可以减少胰岛素用量并有效控制血糖水平，而且可以明显改善2型糖尿病的湿热证候[1]。本研究通过分析葛根芩连汤治疗2型糖尿病湿热证与肠道菌群的变化关系，探讨2型糖尿病湿热证候疗效的相关机制。

我们认为2型糖尿病湿热证肠道菌群成分和结构具有一定的特异性和相似性，肠道菌群同样影响2型糖尿病湿热证候。本研究没有纳入正常人作为对照，仅对2型糖尿病湿热证中药治疗前后肠道菌群进行了分析。治疗前在肠道菌群的PLS－DA和树状图中两组研究对象没有差异；在治疗后，通过对肠道菌群的定量分析发现，实验组两种细菌Bacteroides和Fusobacterium在比对了对照组后发生了特异性的变化。湿热证减分率越低，Bacteroides含量越高，提示治疗无效可能与Bacteroides含量相关；而湿热证减分率越高，Fusobacterium含量越高，提示治疗有效可能与Fusobacterium含量相关。

肠道菌群存在互相竞争抑制作用，有研究认为Bacteroides作为一种革兰阴性菌是一种主要的致炎细菌，增加肠道粘膜的通透性，促进炎症的形成，葛根芩连汤的抗炎作用可能抑制它们的生长。而Fusobacterium作为一种革兰阳性菌是一类能产丁酸的细菌，丁酸能促进肠道合成粘蛋白，保护肠黏膜的完整性[4]。通过本研究，我们认为Bacteroides和Fusobacterium可以作为葛根芩连汤治疗湿热证2型糖尿病疗效的标志物，同时也可以为靶向治疗2型糖尿病提供合适的靶标。

葛根芩连汤在一定程度上改善了肠道微生态，能有效抑制致炎细菌、促进益生菌的生长。葛根芩连汤中黄岑、黄连均有抗炎抗病毒作用，葛根解热消炎，甘草利尿解毒，葛根芩连汤可能通过改变肠道菌群，进而影响患者治疗后的中医湿热证候。近年的动物或临床研究试验发现，葛根芩连汤具有显著的降糖、降血脂的效果，同时显著调节了肠道菌群产生的代谢物，在2型糖尿病等代谢性疾病的治疗上具有巨大的应用潜力。

[1]曾艺鹏，黄云胜，胡蕴刚，等.葛根芩连汤配合胰岛素强化治疗湿热证2型糖尿病临床观察[J].中国中西医结合杂志，2006，26（6)：514～520.

[2]国家中医药管理局.中药新药临床研究指导原则（试行) [M].北京：中国医药科技出版社，2002.

[3]杨维娜，李冬民，曹三成，何岚，吕社民.2型糖尿病各并发症及影响因素的临床分析[J].临床和实验医学杂志，2012，8：573～575.

[4]Egshatyan L，Kashtanova D，Popenko A，et al.Gut microbiota and diet in patients with different glucose tolerance[J].Endocrine connections，2016，5（1)：1～9.

Effect of Intestinal Flora of Type 2 Diabetes Patients with Dampness－heat Syndrome Treated with Gegen Qinlian Decoction

ZENG Yipeng，FENG Xinge，GU Chengying，et al

（Shanghai Pudong Hospital，Fudan University，Shanghai Pudong201399，China)

Objective：To observe the effect of Gegen Qinlian Decoction in treating type 2 diabetes patients with dampness－heat syndrome and the effect of intestinal flora.Methods：Forty－two type 2 diabetes patients with damp－heat syndrome were randomly divided into 2 groups：the control group was treated with Western medicine alone，and the experimental group was treated with integrated Traditional and Western medicine.The fecal samples were collected to extract bacterial genome DNA，and the composition was investigated by Illumina Miseq high－throughput sequencing of the V3 region of the 16S rRNA gene.Species in feces were also measured by real－time quantitative PCR.The relationship between effectiveness and gut microbiota was observed after treatment.Results：The total effectiveness of experimental group was higher than that of control group.Bacteroides correlated negatively with the reduction rate of dampness－heat syndrome，while Fusobacterium correlated positively with the reduction rate of dampness－heat syndrome.Conclusion：The combination of Gegen Qinlian Decoction with Western medicine has the effective treatment among type 2 diabetes patients with dampness－heat syndrome，and Bacteroides and Fusobacterium could be the markers of effectiveness.

Dampness－heat syndrome； Type 2 diabetes； Gut microbiota； Gegen Qinlian Decoction

1006－6233（2016)10－1731－04

A【doi】10.3969/j.issn.1006－6233.2016.10.064

上海市浦东新区科技发展基金项目，（编号：PKJ2012－Y20）；上海市浦东新区传统型中医临床示范学科建设项目，（编号：PDZXK－3－2013009）