葛根芩连汤对感染大肠杆菌小鼠血常规、血液内毒素及炎性细胞因子含量的影响

王 新，张巍巍，杨 婧，丛 霞，秦志华， 宋学文，张林林，郭 沛，单 虎*

(青岛农业大学动物医学院，山东青岛 266109)

产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli, ETEC)是引发断奶仔猪腹泻的重要病原菌之一，黏附性菌毛K88是主要致病因子[1-2]。目前临床上治疗仔猪大肠杆菌性腹泻是以抗生素为主，但是由于抗生素的不规范使用导致大肠杆菌多重耐药、交叉耐药及药物残留的问题日趋严重，不仅造成环境的污染，而且严重威胁着人类的身体健康[1]。而中医在上千年的发展进程中产生了大量“对症下药、辨证施治、标本兼治”的经典方剂，葛根芩连汤就是经典方剂之一，其在治疗菌痢、肠伤寒等疾患中疗效显著，同时中草药具有低残留、不易产生耐药性等优点，受到国内外专家学者的关注[3-4]。本研究探讨葛根芩连汤对于感染大肠杆菌小鼠血常规、血液内毒素及炎性细胞因子含量的影响，旨在为临床应用葛根芩连汤防治仔猪大肠杆菌性腹泻提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验试剂 氯化钠注射液购自贵州天地药业有限责任公司，批号H52020070；TNF-α、IL-1β和IL-6酶联免疫检测试剂盒(48T)均购自南京建成生物工程研究所，批号分别为2018012501、2018012503、2018012509；内毒素检测鲎试剂盒购自厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，批号171018。

1.1.2 试验药物 葛根、黄芩、黄连、炙甘草均购自山东省青岛市城阳人民医院，批号分别为104303、104301、140103、104120；氟苯尼考溶液购自天津市诺维动物药业有限公司，批准文号兽药字(2014)020132111。

1.1.3 试验菌株 大肠杆菌K88(青岛农业大学动物医学院临床诊断学实验室惠赠)

1.1.4 试验动物 SPF级昆明系小鼠，体重18～22 g，购自山东省济南市朋悦实验动物繁育有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 药液制备 参照《中国人民共和国药典》中记载的中药煎煮方法，“先煮葛根、后纳诸药”。称取所需中药，用分体式电子智能保健煲煎煮两次。第一次煎煮加入 8倍量的水将药材浸泡30 min，加热煎煮1 h，将药液经四层纱布过滤后装入1000 mL烧杯中，第二次加4倍量的水，加热0.5 h，经四层纱布过滤后，将两次煎煮药液合并，浓缩为1 g/mL 的中药原液，高压蒸汽灭菌后放入4 ℃冰箱备用。

1.2.2 葛根芩连汤预防试验和治疗试验

1.2.2.1 分组及试验设计 预防试验：选取健康且体重相近昆明系小鼠80只，随机分为葛根芩连汤组、氟苯尼考组、模型组、对照组，每组20只，雌雄各半。葛根芩连汤组及氟苯尼考组小鼠攻毒之前连续给药5 d，并分别灌服1 mL葛根芩连汤(浓度1 g/mL)、1%的氟苯尼考溶液1 mL，模型组和对照组灌服等量的生理盐水。葛根芩连汤组、氟苯尼考组和模型组分别于最后一次给药3 h后腹腔注射0.1 mL大肠杆菌菌液(5×107CFU/mL)，对照组注射等量的生理盐水。

治疗试验：试验分组同预防试验，葛根芩连汤组、氟苯尼考组和模型组分别于第一次给药前3 h，腹腔注射0.1 mL大肠杆菌K88菌液(5×107CFU/mL)，对照组注射等量的生理盐水。攻毒3 h后葛根芩连汤组灌服浓度1 mL葛根芩连汤(浓度1 g/mL)，氟苯尼考组灌服1%的氟苯尼考溶液1 mL，模型组、对照组灌服等量的生理盐水。

1.2.2.2 样品采集与保存 小鼠攻毒12 h后进行眼眶后静脉丛采血，将血液采集至肝素钠抗凝管中用于血常规检测，另采集血液至1.5 mL离心管中，室温放置30 min后3500 rpm/min 离心10 min，收集血清于-20 ℃保存，并保证避免反复冻融。

1.3.1 小鼠死亡率的统计 记录并统计攻毒后48 h内各组的死亡数以及死亡率的动态变化。

1.3.2 血常规指标检测 检测小鼠血液中白细胞、红细胞、血小板等血常规指标。

1.3.3 血液中细菌内毒素的含量 参照终点显色法显色基质鲎试剂盒说明书进行内毒素的含量测定。

1.3.4 血液中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量 参照酶联免疫检测试剂盒说明书，检测血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

1.4 数据处理 数据采用SPSS22.0统计软件中ANOVA(one way analysis of variance)法，用Duncan法进行均值的多重比较。结果用x±s表示。

2 结果与分析

2.1 小鼠死亡数和死亡率的动态变化 根据表1可知，预防和治疗试验中，模型组与对照组、葛根芩连汤组、氟苯尼考组相比死亡总数及死亡率均差异极显著(P<0.01)；预防试验中，氟苯尼考组死亡率低于葛根芩连汤组，差异不显著(P>0.05)；治疗试验中，氟苯尼考组死亡率高于葛根芩连汤组，差异不显著(P>0.05)。

表1 小鼠死亡总数与死亡率的变化 (n=20)Tab 1 The dynamic changes of death ang mortality in mice (n=20)

与模型组相比，aP<0.05，bP<0.01

Compared with model group,aP<0.05，bP<0.01

2.2 葛根芩连汤对感染大肠杆菌K88小鼠血常规指标的影响 由表2可知，预防试验中，模型组的白细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞的数目均极显著地高于对照组(P<0.01)，淋巴细胞数目显著地高于对照组(P<0.05)。葛根芩连汤组和氟苯尼考组白细胞、中性粒细胞、单核细胞数目均极显著地高于对照组(P<0.01)，并且极显著地低于模型组(P<0.01)，嗜酸性粒细胞数目与对照组相比显著增高(P<0.05)，同时极显著低于模型组(P<0.01)。模型组以及葛根芩连汤组的红细胞数目、血红蛋白浓度极显著地低于对照组(P<0.01)；但葛根芩连汤组红细胞数目、血红蛋白浓度显著地高于模型组(P<0.05)。氟苯尼考组的红细胞数目与对照组没有差异，血红蛋白浓度显著高于对照组(P>0.05)，血小板数目，与对照组相比极显著地降低(P<0.01)，而与葛根芩连汤组相比极显著升高(P<0.01)；氟苯尼考组血小板数目与模型组没有差异。

由表3可知，与对照组相比，模型组白细胞、中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数目显著地增高(P<0.05)，红细胞数目、血红蛋白浓度、血小板数目极显著地降低(P<0.01)；葛根芩连汤组的白细胞、中性粒细胞、单核细胞的数目极显著高于对照组(P<0.01)，并且极显著低于模型组(P<0.01)，同时淋巴细胞、嗜酸性粒细胞数目也均极显著(P<0.01)低于模型组，以及血红蛋白浓度、血小板数目均显著地低于对照组(P<0.05)，且均显著高于模型组(P<0.05)；氟苯尼考组中性粒细胞数目与葛根芩连汤组相比差异极显著(P<0.01)，并且极显著高于葛根芩连汤组，血小板数目与葛根芩连汤组相比差异显著(P<0.05)，并且显著低于葛根芩连汤组。

表2 预防试验小鼠血液中白细胞、红细胞、血红蛋白及血小板的数目(n=20)Tab 2 The content of WBC, RBC, Hb and platelet in blood of mice in prevention group (n=20)

同行数据肩标小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不同大写字母相同表示差异显著(P<0.05)，大小写字母均不同表示差异极显著(P<0.01)

The same row compares, the same lowercase letter means no significant difference (P>0.05), different lowercase letter means significant differences (P<0.05). And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)

表3 治疗试验小鼠血液中白细胞、红细胞、血红蛋白及血小板的数目Tab 3 The content of WBC, RBC, Hb and platelet in blood of mice in treatment group

同行数据肩标小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不同大写字母相同表示差异显著(P<0.05)，大小写字母均不同表示差异极显著(P<0.01)

The same row compares, the same lowercase letter means no significant difference (P>0.05), different lowercase letter means significant differences (P<0.05). And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)

2.3 小鼠血液中细菌内毒素的含量变化 由表4可知，预防试验中，对照组、葛根芩连汤组及氟苯尼考组的内毒素含量极显著低于模型组(P<0.01)，且葛根芩连汤组极显著高于对照组(P<0.01)，氟苯尼考组与对照组相比差异不显著，葛根芩连汤组与氟苯尼考组相比差异不显著。治疗试验中，对照组和葛根芩连汤组的内毒素含量极显著低于模型组(P<0.01)，且葛根芩连汤组极显著高于对照组(P<0.01)；氟苯尼考组的内毒素含量与模型组含量差异显著(P<0.05)，与对照组相比差异极显著(P<0.01)，并且极显著高于对对照组(P<0.01)。

2.4 小鼠血液中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量变化

由表5可知，预防试验中，模型组TNF-α、IL-1β和IL-6含量均极显著高于其它三组(P<0.01)；与对照组相比，葛根芩连汤组三种炎性因子的含量均显著地降低(P<0.05)，氟苯尼考组与对照组无显著性差异(P>0.05)；氟苯尼考组IL-1β、IL-6显著高于葛根芩连汤组(P<0.05)，氟苯尼考组TNF-α极显著高于葛根芩连汤组(P<0.01)。治疗试验中，模型组TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均极显著地高于其它三组(P<0.01)；葛根芩连汤组、氟苯尼考组TNF-α、IL-1β和IL-6的含量与对照组相比均差异不显著(P>0.05)；葛根芩连汤组与氟苯尼考组三种炎性因子之间均均差异不显著(P>0.05)。

表4 各组小鼠血液中细菌内毒素的含量 (EU/mL)Tab 4 The content of bacterial endotoxin in every group(EU/mL)

同列数据肩标小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不同大写字母相同表示差异显著(P<0.05)，大小写字母均不同表示差异极显著(P<0.01)

The same column compares, the same lowercase letter means no significant difference (P>0.05), different lowercase letter means significant differences (P<0.05). And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)

表5 小鼠血液中炎性因子的含量(ng/L)Tab 5 The content of inflammatory factors(ng/L)

同列数据肩标小写字母相同表示差异不显著(P>0.05)，小写字母不同大写字母相同表示差异显著(P<0.05)，大小写字母均不同表示差异极显著(P<0.01)

The same column compares, the same lowercase letter means no significant difference (P>0.05), different lowercase letter means significant differences (P<0.05). And with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)

3 讨论与结论

3.1 葛根芩连汤对小鼠死亡率的影响 郭莎莎[5]、王华龙[6]研究发现葛根芩连汤可以有效地治疗大肠杆菌性腹泻，治愈率为98.45%。本试验中葛根芩连汤表现出了较好的预防和治疗大肠杆菌病的作用，并且预防效果接近于氟苯尼考，治疗效果优于氟苯尼考，结果与以上文献报道一致。

3.2 葛根芩连汤对小鼠血常规指标的影响 白细胞分为粒细胞、单核细胞、淋巴细胞三大类，其中粒细胞又可分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。当发生细菌性感染时白细胞会出现病理性升高，其中以单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞的升高最为明显，活化的白细胞还能够分泌产生TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎细胞因子，细胞因子的出现还能够继续趋化、激活白细胞。预防试验与治疗试验研究发现，葛根芩连汤组与模型组的各类白细胞数目均高于对照组，说明大肠杆菌感染小鼠后能够引起小鼠体内一系列免疫反应。段凯文[7]等报道，黄连黄芩均能够增强巨噬细胞的吞噬功能。故本试验在攻毒12 h后检测血细胞变化，发现葛根芩连汤组各类白细胞数目均低于模型组，由此推测葛根芩连汤中的有效成分可通过增强白细胞吞噬能力，在加速白细胞吞噬过程中抑制促炎细胞因子的释放，使得该中药方剂产生的一系列保护作用进而减轻小鼠体内的炎症反应。

试验研究发现攻毒后的小鼠红细胞及血红蛋白含量均有所降低，但经葛根芩连汤治疗后，小鼠血液中红细胞各项水平均有明显提升。这可能是由于葛根芩连汤通过降低小鼠血液中的内毒素含量，进而提高血液中红细胞的水平。研究报道，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能够抑制红细胞生成，还能够激活凝血因子Ⅶ，进而启动内源性凝血途径[8,9]。同时，试验研究发现模型组小鼠在注射大肠杆菌后血小板明显减少，葛根芩连汤组的血小板数目与对照组非常接近，可见葛根芩连汤对于因大肠杆菌感染引起的血小板减少症有明显的保护作用。模型组血小板减少可能与血小板过度消耗以及LPS侵入体内引起的弥散性血管内凝血有关[10]。邱艳萍[11]研究证明应用黄连素有抗血小板凝集的作用，并能够用于防治脑血管中发生血小板血栓。

3.3 葛根芩连汤对血液中内毒素含量的影响 大肠杆菌K88主要以菌毛、肠毒素和细菌崩解后产生的内毒素发挥致病作用，进而可导致机体发生腹泻[12]。同时，革兰氏阴性菌细胞壁中的LPS在细菌死亡崩解时大量释放并且进入循环血液，造成内毒素血症[13]。前期已通过预试验对攻毒小鼠体内介导炎症反应的受体表达量进行监测，发现攻毒后12 h小鼠体内炎症反应最强烈，预防试验与治疗试验中葛根芩连汤组与氟苯尼考组、模型组均检测出一定浓度的内毒素，但是葛根芩连汤组在预防试验和治疗试验中其内毒素的含量均极显著低于模型组(P<0.01)，与章常华[14]等对于葛根芩连汤在代谢性疾病的治疗过程中能够显著降低小鼠血清中LPS的结论一致。同时，试验结果验证了葛根芩连汤通过降低小鼠血液中的内毒素含量，进而提高血液中红细胞和血小板的水平。

3.4 葛根芩连汤对TNF-α、IL-1 β和IL-6分泌影响 TNF-α、IL-1 β和IL-6都属于炎症细胞因子，TNF-α能够促进IL-1 β和IL-6的分泌，在发生炎症和细胞凋亡的过程中具有重要意义[15]。试验研究发现葛根芩连汤组小鼠血清中三种因子的含量与对照组相比均有所降低，这与易文[16]、马建强[17]、赵月蓉[18]等人对相关中药研究得出的中药能够抑制炎症介质的合成与释放结论相一致，而氟苯尼考组三种因子含量显示与对照组没有差异，由此可初步推测葛根芩连汤防治大肠杆菌病的免疫学机理。

3.5 结论 葛根芩连汤对感染大肠杆菌K88小鼠具有预防和治疗的作用。葛根芩连汤主要是通过降低血液中的内毒素及炎性因子的含量，进而降低机体炎症反应水平，发挥保护作用。