Src同源酪氨酸磷酸酶（Shp2）在雄性生殖调控的研究进展

郭凯敏刘凌云综述 田润辉审校

1. 吉林大学第一医院男科（吉林 130021）；2. 吉林大学第一医院心理科

Src同源酪氨酸磷酸酶（Shp2）在雄性生殖调控的研究进展

郭凯敏1刘凌云1综述 田润辉2审校

1. 吉林大学第一医院男科（吉林 130021）；2. 吉林大学第一医院心理科

S r c同源酪氨酸磷酸酶（S r c h o m o l o g y phosphotyrosyl phosphatase2， Shp2）是非受体蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase， PTP）家族成员之一，由蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型11（protein tyrosine phosphatase nonreceptor11，PTPN11）基因编码并在人类细胞和组织中广泛表达，参与细胞多种生物活动，包括细胞的增殖、分化、有丝分裂、器官发育、免疫反应以及代谢过程。已有大量研究显示Shp2参与多种疾病的发生，如全身系统肿瘤（胰腺癌［1］、肺癌［2］、肝癌［3］、乳腺癌［4］等），在介导细胞增殖和分化过程中，Shp2是关键的细胞内调控因子，其作用已被广泛揭示。而Shp2 在睾丸组织的表达以及调控精子方面的研究最近才成为热点。本文就近些年Shp2在雄性生殖的调控方面做一综述。

一、Shp2在睾丸细胞中的表达和定位

Shp2的结构是由两个SH2（N-SH2和C-SH2）结构域、一个单一的PPT区以及一个含有磷酸化位点的C端亲水尾部结构组成。由于和区之间的亲密互作，它表现为一个低的基础催化活性，以保持磷酸酶处于一个自动抑制的封闭构象。因此，它的催化活性需要通过释放这些互作而打开，这个反应发生在它的结构域结合于在上游信号传导搭档上发现的特定磷酸酪氨酸基序［5］。目前普遍认为Shp2在发育方面至关重要的作用离不开它在不同竞争物的应答中促进Ras/MAPK通路激活，而且在许多雄性繁殖过程，包括精子发生、精子成熟、支持细胞和精原细胞粘附、以及血睾屏障的动态性改变中，Shp2发挥了正向调控作用。

Puri等［6］应用免疫荧光技术发现Shp2在睾丸支持细胞细胞核和细胞浆中高表达，而且在位于血睾屏障周围生精小管基底膜部的支持细胞表达更为显著，同时其表达水平在睾丸全部发育过程中基本保持稳定。在睾丸生殖细胞中，Shp2表达于大部分未成熟的单个A形精原干细胞（As）和链状A形精原干细胞（A aligned）精原细胞细胞核、胞浆以及质膜。质膜的Shp2检测水平与质膜受体磷酸酶的相互作用相关。而分化的精原细胞、精母细胞和精子细胞不表达Shp2，其调控精原细胞分化机制方面目前尚不清楚。

二、Shp2维持精子生成

有研究显示，Noonan 综合征和Leopard综合征都与Shp2的编码基因PTPN11点突变有关，而这两种先天性疾病均表现为男性不育［7，8］。Yoon等［9］发现Noonan 综合征PTPN11点突变多达47种。Shp2完全缺失能引起胚胎原肠腔神经节、脊索和脊索后延伸缺陷，造成胚胎发育停滞［10］。在维持成年小鼠精子生成方面，Puri等［6］通过哺育PTPN11floxed小鼠，将他莫昔芬结合蛋白结合域和泛素启动子融合到Cre重组酶，构建了条件性基因敲除小鼠模型，发现敲除29d后小鼠生精小管精原细胞和精母细胞缺失，敲除43d后除部分成熟的长型精子细胞外，其余睾丸各级生精细胞均缺失。同时，发现残存的精子细胞分布散乱，个别细胞顶体部位变异。在敲除63d后，生精小管各级生精细胞均缺失。这提示Shp2 基因敲除可以影响未分化精原细胞的产生，而并不直接影响分化精原细胞和成熟精子细胞的存活。另外，Puri［6］将PTPN11floxed小鼠与 Vasa Cre 小鼠交配 建立了生殖母细胞特异性Shp2 基因敲除模型（GCPTPN11KO），此时胚胎发育15d，精原干细胞（SSC）未形成，3～4周时敲除小鼠生殖细胞进行性减少，8周后生殖细胞全部消失，从而认为Shp2 对出生后小鼠睾丸精子形成起重要作用。

小鼠出生后5d睾丸中可以存在两种生殖母细胞，一种形成SSC ，负责后续精子的产生。另一类的生殖母细胞可以一次性绕过SSC和未分化精母细胞阶段，这类细胞直接分化形成A1型精母细胞，进而分化产生精子，称为第一阶段精子形成［11］。因此，研究发现GCPTPN11KO 小鼠可以正常形成第一阶段精子，这与未分化精母细胞未检测到Shp2表达一致［6］。这提示Shp2可能在维持A1分化精原细胞与和后续生殖细胞产生方面作用局限，而其重要作用表现在SSC增殖以及精子持续生成方面。与之相比，Shp2敲除小鼠出生后5d SSC和未分化精原细胞增加50%，而出生后7d由于细胞凋亡造成这些细胞下降60%。可见Shp2对SSC增殖和精子持续生成至关重要。已有研究显示Shp2条件性基因敲除小鼠可以抑制多种类型细胞（如神经干细胞、造血干细胞（HSC）、心脏祖细胞和T细胞）增殖［12］。Shp2抑制因子能够通过SSC增殖启动子bFGF和GDNF调控，进而抑制ERK信号激活，在体外抑制SSC增殖。

三、Shp2在SSC自我更新及分化中的作用

已有大量研究证实Shp2 在造血干细胞和神经干细胞更新分化中的作用［13-15］，而其在SSC的研究较少。SSC的自我更新主要由细胞因子GDNF、bFGF、集落刺激因子（CSF-1）、以及趋化因子配体（CXCL12）调控［16］。这些因子在SSC更新尽管没有详细的描述，然而GDFN和bFGF 在富集培养SSC中激活的AKT，介导的ERK磷酸化发挥作用已被广泛认可［17］。ERK和AKT激活产生的活性氧ROS刺激GFRA1和FGFR受体后可以促进SSCs自我更新和增殖［18］。Shp2参与体细胞GDNF和bFGF介导的信号通路，以及在体外SSC中Shp2活性是GDFN和bFGF诱导ERK磷酸化的必要条件。目前尚不清楚是否在SSC中Shp2可以通过GDNF和bFGF调控AKT激活。因此，仍然需要进一步研究证实Shp2是否能够引起激活不同的AKT或ERK通路从而决定细胞自我更新或分化。

STAT3是一种促进SSC分化和抑制自我更新的转录因子，由它调控的信号旁路可能是Shp2 介导的SSC分化的潜在靶点［19］。Shp2通过STATS3磷酸化将其激活［20，21］， STAT3激活后可以刺激SALL4表达，后者可以隔离ZBTB16基因，从而表达转膜受体c-kit，最终促进精原细胞分化［22］。STAT3 也可以诱导NGN3转录因子生成，后者再与E-box转录因子相互作用，引起促进SSC分化基因的表达［23］。可见，Shp2介导的STAT3和NGN3下调是阻滞SSC分化的机制之一。SSC中Shp2的下游靶点ETV5和BCL6B也是SSC自我更新的重要转录因子［24］。而这些因子接受bFGF 和 GDNF通过PTPN11依赖的MAPK通路正向调控［25］（如图1）。

图1　Shp2激活SSC增殖、自我更新、分化的细胞通路

研究显示，敲除生殖细胞Shp2基因能够通过抑制SSC增殖而诱导生精阻滞，而敲除支持细胞Shp2基因可以干扰旁分泌因子的表达，促进SSC过度分化［27］。后者基因敲除引起SSC来源的未分化精母细胞从出生后第二周开始迅速减少，以及分化成熟的精母细胞过早出现，同时Shp2可以很大程度上修复支持细胞细胞连接以及SSC克隆形成。早幼粒细胞白血病锌指蛋白（PLZF）是SSC和未分化精母细胞的特异性标志物，基因敲除小鼠以及Shp2loxp/loxp小鼠中，PLZF阳性的细胞数只在出生后一周内数量保持相同，随着小鼠增龄数量急剧下降，支持细胞Shp2基因敲除引起SSC维持受损。此外，尽管目前尚不能明确促进SSC自我更新基因表达的改变是否与Shp2基因敲除有关，但是Shp2缺陷的支持细胞中编码分化促进因子基因上调。这些研究提示支持细胞Shp2基因缺失破坏SSC维持自我更新和分化间的平衡，通过诱导SSC分化而阻止生殖细胞的补充储备［27］。可见，支持细胞正常表达的Shp2是保持SSC自我更新和分化之间相互平衡的必要条件，也是维持精子持续生成和生育力的重要因素。

四、Shp2调控血睾屏障的完整性和SSC的附着

血睾屏障（BTB）是睾丸中毛细血管和支持细胞之间的紧密连接形成，将生精小管分为基底部和顶部，它为精原细胞提供营养。血睾屏障破坏可以造成睾丸生精细胞脱落以及分化、发育阻滞［28］。血睾屏障周期性结构更新可以促进精原细胞从生精小管基底部向管腔部转运，其中激酶介导的信号级联反应在血睾屏障维持和重塑中起关键作用。Puri等［6］研究发现组成性激活Shp2突变体SHP2Q79R的表达可以减小支持细胞跨膜电阻，从而破坏体外支持细胞之间的黏附。在生精周期一些特定阶段，支持细胞和生精细胞会分泌一系列细胞因子来调节BTB的开闭以及精子的形成［29］。肝细胞生长因子（HGF）是个调节血睾屏障重要的生长因子，它可以刺激体外支持细胞增加SRC和ERK活性，减低细胞跨膜电阻，是Shp2的上游调控因子。Shp2可同HGF 受体（c-Met）衔接蛋白（Gab1）相互作用从而负调节MAPK通路激活［30］。

体外大鼠睾丸支持细胞的研究表明，组成性激活Shp2通过降低桩蛋白的磷酸化，引起负调节因子SRC与CSK解离，从而激活ERK，导致表达SHP2Q79R的支持细胞间粘附调节因子FAK 失活，稳定细胞间黏附的细胞骨架破坏［31］。最终，组成性激活的Shp2改变引起紧密连接蛋白ZO-1，衔接蛋白β-catenin和转膜蛋白N-cadherin从质膜细胞粘附部位与支持细胞胞浆发生定位改变。这些表明Shp2对于维持SSC之间和SSC和支持细胞间黏附有重要意义。

五、Shp2调节间质细胞睾酮生成

睾酮是重要的雄性激素和合成代谢类固醇，在雄性中主要由睾丸间质细胞产生。促卵泡激素刺激间质细胞产生cAMP增加，激活蛋白激酶A，通过上调转运体急性调节蛋白（STAR）促进胆固醇转运至线粒体，从而刺激激素合成通路合成类固醇。酰基辅酶A合成酶（ACSL4）和酰基辅酶A硫解酶（ACOT2）可以调控花生四烯脂氧化和环氧化代谢产物产生，进而增强STAR表达［32］。最近研究发现［33］Shp2是间质细胞ACSL4 表达的重要调控因子，用Shp2的抑制剂NSC87877可以在体外抑制间质细胞产生睾酮。此外，shRNA调控的Shp2基因敲除引起的睾酮含量减少与ACSL4 和STAR蛋白含量减低相关。而Shp2过表达可以提高ACSL4和STAR蛋白以及睾酮的含量。Shp2能够通过胞浆MAPK和PI4K-Akt通路调控FSH以及睾酮的产生。此外，Shp2基因敲除能够抑制线粒体融合这一重要的睾酮产生过程［34］。

国内学者蔡晓黎等发现，出生后小鼠Shp2连续性表达以及在特定发育阶段表达量的明显波动，预示Shp2参与小鼠出生后睾丸发育的全过程，此外检测小鼠血清中睾酮水平，发现Shp2在全部睾丸发育过程中的表达模式与小鼠血液中睾酮水平趋势变化基本吻合［35］。可见，Shp2对睾丸发育和睾酮生成持续发生作用。

综上所述，Shp2在精子生成、精原细胞自身更新分化以及雄激素的生成方面起重要作用。目前Shp2研究还停留在动物水平，在男性不育人群中的未见报道，对其深入研究有利于揭示男性不育症的发病机理，同时也可能为不育的治疗提供理论依据，Shp2抑制剂可能代替传统的手术结扎成为控制雄性生育的方法之一。总之，Shp2 能否应用于实践仍需要大量研究。

致谢：本文受吉林省财政厅科研专项资助（项目卡编号3D5157343428）基金项目资助

含SH2域蛋白质酪氨酸磷酸酶类； 精子发生； 雄激素类

1 Zheng J， Huang S， Huang Y， et al. Tumour Biol 2016；37（6）： 7853-7859

2 Chen CL， Chiang TH， Tseng PC， et al. Biochem Biophys Res Commun 2015； 466（3）：578-584

3 Han T， Xiang DM， Sun W， et al. J Hepatol 2015； 63（3）：651-660

4 Li J， Kang Y， Wei L， et al. PLoS One 2014； 9（7）： e102847

5 Bertotti A， Comoglio PM， Trusolino L. J Cell Biol 2006；175（6）： 993-1003

6 Puri P， Phillips BT， Suzuki H， et al. Stem Cells 2014；32（3）： 741-753

7 Tajan M， de Rocca Serra A， Valet P， et al. Eur J Med Genet 2015； 58（10）： 509-525

8 Grossmann KS， Rosario M， Birchmeier C， et al. Adv Cancer Res 2010； 106： 53-89

9 Yoon SR， Choi SK， Eboreime J， et al. Am J Hum Genet 2013； 92（6）： 917-926

10 Saxton TM， Henkemeyer M， Gasca S， et al. EMBO J 1997； 16（9）： 2352-2364

11 Yoshida S， Sukeno M， Nakagawa T， et al. Development 2006； 133（8）： 1495-1505

12 Langdon YG， Goetz SC， Berg AE. Development 2007；134（22）： 4119-4130

13 Chan G， Cheung LS， Yang W， et al. Blood 2011； 117（16）：4253-4261

14 Zhu HH， Ji K， Alderson N， et al. Blood 2011； 117（20）：5350-5361

15 Ke Y， Zhang EE， Hagihara K， et al. Mol Cell Biol 2007；27（19）： 6706-6717

16 Chen SR， Liu YX. Reproduction 2015； 149（4）：R159-R167

17 Ishii K， Kanatsu-Shinohara M， Toyokuni S， et al. Development 2012； 139（10）： 1734-1743

18 Morimoto H， Iwata K， Ogonuki N， et al. Cell Stem Cell 2013； 12（6）： 774-786

19 Oatley JM， Kaucher AV， Avarbock MR， et al. Biol Reprod 2010； 83（3）： 427-433

20 Yang Y， Jiang B， Huo Y， et al. Virology 2011； 409（2）：204-210

21 Kim DJ， Tremblay ML， Digiovanni J. PLoS One 2010；5（4）： e10290

22 Hobbs RM， Fagoonee S， Papa A， et al. Cell Stem Cell 2012； 10（3）： 284-298

23 Kaucher AV， Oatley MJ， Oatley JM. Biol Reprod 2012；86（5）： 164， 1-11

24 Catizone A， Ricci G， Caruso M， et al. Mol Cell Endocrinol 2012； 348（1）： 135-146

25 Tyagi G， Carnes K， Morrow C， et al. Biol Reprod 2009；81（2）： 258-266

26 Puri P， Walker WH. Semin Cell Dev Biol 2016； pii：S1084-9521（16）30020-30029

27 Hu X， Tang Z， Li Y， et al. Sci Rep 2015； 5： 12982

28 Wong CH， Cheng CY. Curr Top Dev Biol 2005； 71： 263-296

29 秦茂， 张秀平， 刘保兴. 中国男科学杂志 2014； （10）： 65-67

30 Schaeper U， Gehring NH， Fuchs KP， et al. J Cell Biol 2000； 149（7）： 1419-1432

31 Puri P， Walker WH. Biol Reprod 2013； 88（3）： 59

32 Duarte A， Castillo AF， Castilla R， et al. FEBS Lett 2007；581（21）： 4023-4028

33 Cooke M， Orlando U， Maloberti P， et al. J Lipid Res 2011；52（11）：1936-1948

34 Duarte A， Poderoso C， Cooke M， et al. PLoS One 2012；7（9）： e45829

35 蔡晓黎， 耿果霞， 刘亚伟， 等. 中国畜牧兽医 2013；40（11）： 143-147

（2016-05-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.07.016

R 698.2