不同铜源对Caco-2细胞内铜-ATP酶二价金属离子转运体1和金属硫蛋白含量的影响

高　晨，朱连勤，朱风华，王学鑫，张　婷，张　静

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109；2.德州学院农学系，山东 德州 253023）

不同铜源对Caco-2细胞内铜-ATP酶二价金属离子转运体1和金属硫蛋白含量的影响

高晨1，2，朱连勤1，朱风华1，王学鑫1，张婷1，张静1

（1.青岛农业大学动物科技学院，山东 青岛 266109；2.德州学院农学系，山东 德州 253023）

利用Caco-2细胞模型研究不同浓度硫酸铜，微米氧化铜，纳米氧化铜（铜水平2、4、8、16 mg/L）对细胞铜-ATP酶、二价金属离子转运体1（Divalent Metal Transporter 1，DMT1）、金属硫蛋白（metallothionein，MT）含量的影响。结果显示，培养液中添加铜离子能提高Caco-2细胞铜-ATP酶、MT含量，低浓度铜离子能提高细胞DMT1含量，高浓度铜离子降低细胞DMT1含量。纳米氧化铜对几种铜转运蛋白的作用与硫酸铜类似，但纳米氧化铜对铜-ATP酶、MT、DMT1含量的影响更加明显。

纳米氧化铜；Caco-2细胞；铜-ATP酶；金属硫蛋白；二价金属离子转运体1

铜作为机体必需的微量元素之一。目前饲料中常用的铜源有硫酸铜和氧化铜等，但传统铜源存在吸收率低、污染环境等缺点。随着纳米科技的兴起，纳米微量元素添加剂步入人们视野，有研究表明，饲料中添加纳米氧化铜效果优于硫酸铜和氧化铜，其生物学作用强，生物利用率高［1-3］。然而，纳米氧化铜在动物体内吸收转运机制并不清楚，仍需进一步研究。本试验以Caco-2细胞为模型，研究不同铜源对铜-ATP酶、金属硫蛋白（metallothionein，MT）、二价金属离子转运体1（Divalent Metal Transporter 1，DMT1）的影响，探讨纳米氧化铜在吸收转运时的特点，为进一步研究和开发纳米氧化铜提供参考数据。

1　材料与方法

1.1细胞株Caco-2细胞，购自中国科学院上海细胞库。

1.2试验设计将Caco-2细胞按1×105/mL的浓度接种于6孔板中，在37℃、5%CO2下培养20 d后，换入含有不同铜源的DMEM培养液（3 mL/孔）。设12个试验组，硫酸铜、微米氧化铜和纳米氧化铜3种铜源分别设4个组（铜水平2、4、8、16 mg/L）；对照组加培养液3 mL/孔；每组6个重复。继续作用24 h后，收集细胞检测相关指标。

1.3检测指标与方法采用BCA法检测Caco-2细胞蛋白含量。利用铜-ATP酶测试盒、金属硫蛋白测试盒、二价金属离子转运体测试盒检测Caco-2细胞中铜-ATP酶、MT、DMT1含量。

1.4数据分析利用SPSS17.0统计软件进行分析，数据处理应用单因素方差分析和LSD多重比较。数据均采用-X±SD表示。

2　结果

2.1不同铜源对Caco-2细胞内铜-ATP酶活性的影响结果显示，培养液铜水平为2、4 mg/L时，添加纳米氧化铜组的铜-ATP酶活性高于硫酸铜和微米氧化铜组（P＜0.05）。培养液铜水平为8 mg/L时，添加硫酸铜组的铜-ATP酶活性高于纳米氧化铜组（P＜0.05）。硫酸铜和纳米氧化铜对Caco-2细胞铜-ATP酶活性的影响均呈现随着铜浓度升高先上升后下降趋势（P＜0.05）。见表1。

表1　不同铜源对Caco-2细胞铜-ATP酶活性的影响（μmolPi/mgprot/hour）

2.2不同铜源对Caco-2细胞内MT含量的影响

结果显示，培养液中添加同等铜水平时，纳米氧化铜组Caco-2细胞MT含量高于硫酸铜组和微米氧化铜组（P＜0.05）。纳米氧化铜和硫酸铜对Caco-2细胞MT含量的影响均呈现随培养液铜浓度的升高而升高（P＜0.05）。见表2。

表2　不同铜源对Caco-2细胞MT含量的影响（μg/gprot）

2.3不同铜源对Caco-2细胞内DMT1含量的影响结果显示，培养液铜水平为2 mg/L时，添加硫酸铜Caco-2细胞DMT1含量高于纳米氧化铜和微米氧化铜（P＜0.05）。铜水平为4 mg/L时，添加硫酸铜和微米氧化铜Caco-2细胞DMT1含量高于纳米氧化铜（P＜0.05）。铜水平为8、16 mg/L时，添加微米氧化铜Caco-2细胞DMT1含量高于硫酸铜和纳米氧化铜（P＜0.05）。纳米氧化铜和硫酸铜对Caco-2细胞DMT1含量的影响均呈现随铜浓度的升高而下降（P＜0.05）。见表3。

3　讨论

铜-ATP酶存在于细胞质膜、内质网和高尔基体等亚细胞器中，在调节细胞Cu吸收和平衡方面有重要作用［4］。Xie等报道，添加铜能明显提高大鼠肠上皮细胞中铜-ATP酶（ATP7A）活性［5］。本试验发现，添加低浓度纳米氧化铜能提高Caco-2细胞中铜-ATP酶活性，但当添加高浓度纳米氧化铜时，铜-ATP酶的活性又回落至正常水平，甚至略有下降。可能是由于细胞在短时间内积聚大量的铜，进而细胞通过负反馈调控进入细胞中的铜离子量，是细胞避免铜中毒的一种保护性反应。硫酸铜对铜-ATP酶活性的影响与纳米氧化铜相似。同时发现，纳米氧化铜对铜-ATP酶活性的影响要强于相同浓度的硫酸铜，可能是纳米氧化铜以铜离子和纳米粒子两种形式进入细胞，通过两种途径对细胞铜-ATP酶活性产生影响。添加微米氧化铜后对铜-ATP酶活性没有影响。MT是一类与金属元素具有高度亲和力且能被其诱导的功能特异的蛋白质。铜与MT结合成Cu-MT，保持细胞内铜浓度相对稳定，有效地减低铜的细胞毒性。Darwish等报道，大鼠肝脏细胞中的MT mRNA的表达水平与铜浓度呈正相关［6］。进一步研究发现，在一定浓度范围内，随着培养液中纳米氧化铜水平的升高，Caco-2细胞MT mRNA相对表达量明显升高［7］。本试验发现，随培养液中铜离子浓度增加，Caco-2细胞中MT的含量显著增高，纳米氧化铜对细胞中MT含量影响与硫酸铜类似，但是同等浓度的纳米氧化铜比硫酸铜更能促进MT的生成。DMT1在肠中主要分布于十二指肠绒毛刷状缘等处，DMT1除了摄取Fe2+外，也能对铜离子进行转运［8］。Jiang等对小鼠HEK-293细胞研究发现，随着细胞铜转运量增加，DMT1 mRNA的表达受到抑制［9］。本试验发现，随着培养液中纳米氧化铜浓度的增加，细胞DMT1的生成受到抑制，同时发现同等浓度下纳米氧化铜对DMT1的抑制作用要强于硫酸铜，可能是由于纳米氧化铜以铜离子和纳米粒子2种形式进入细胞为细胞提供了更多的铜，进而抑制DMT1的生成。

表3　不同铜源对Caco-2细胞DMT1含量的影响（μg/gprot）

本试验发现，纳米氧化铜对几种铜转运蛋白的作用与微米氧化铜有较大差异，反而与硫酸铜类似，说明纳米氧化铜在培养液中部分以铜离子形态存在。但纳米氧化铜对铜-ATP酶、MT、DMT1含量的影响更明显，因为纳米氧化铜除了以铜离子形式进入细胞外，还以纳米粒子形式直接进入细胞，通过2种途径来对细胞的铜转运蛋白产生影响。

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Effects of different sources of copper on copper-ATPase，divalent metal transporter content 1，metallothionein in Caco-2 cells

GAO Chen1，2，ZHU Lian-qin1，ZHU Feng-hua1，WANG Xue-xin1，ZHANG Ting1，ZHANG Jing1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.Department of Agronomy，Dezhou University，Dezhou 253023，China）

In this study，we investigated the effects of different concentrations of CuSO4，micron-CuO，nano-CuO（copper levels 2，4，8，16 mg/L）on cell copper-ATPase，DMT1，MT content in Caco-2 cell.The results showed that the culture medium supplemented with copper ions improve the copper-ATPase，and MT content in Caco-2 cells.Low concentrations of copper ions improved DMT1 content and high concentrations of copper ions reduced DMT1 content in Caco-2 cells.Effect of nano-CuO on several copper transporters was similar to CuSO4，but the impact of nano-CuO to copper-ATPase，MT，DMT1 content was more obvious.

Nano-CuO；Caco-2 cell；copper-ATPase；MT；DMT1

ZHU Lian-qin

S852.3

A

0529-6005（2016）04-0049-02

2014-11-26

国家自然科学基金科学部主任基金项目（311400-76）；青岛市科技计划基础项目［12-1-4-5-（5）-jch］

高晨（1979-），男，讲师，博士，研究方向为动物营养代谢病与中毒病，E-mail：gaochen1127@126.com

朱连勤，E-mail：lqzhu@qau.edu.cn