腐败梭菌类毒素抗原含量与免疫效果之间的关系试验

彭小兵，李旭妮，蒋玉文，张爱民，余洪磊，罗显绎，陈　宏，郑明举，沈　方，赵海源

（1.中国兽医药品监察所，北京 海淀 100081；2.中牧实业股份有限公司兰州生物药厂，甘肃 兰州 730046；3.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830032）

腐败梭菌类毒素抗原含量与免疫效果之间的关系试验

彭小兵1，李旭妮1，蒋玉文1，张爱民2，余洪磊3，罗显绎2，陈宏3，郑明举2，沈方2，赵海源3

（1.中国兽医药品监察所，北京 海淀 100081；2.中牧实业股份有限公司兰州生物药厂，甘肃 兰州 730046；3.新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830032）

为了确定腐败梭菌类毒素抗原含量与免疫效果之间的关系，将不同剂量的类毒素分别接种家兔和绵羊，免疫17日后测定血清中和效价，并用1MLD的毒素进行攻毒。测毒结果表明，1个家兔MLD的毒素含量为小鼠MLD的30倍，1个绵羊MLD的毒素含量为小鼠MLD的600倍。血清中和试验和免疫攻毒保护结果表明，类毒素含量与免疫效果在一定的范围内呈正相关，在家兔和绵羊上能提供保护的最小免疫剂量分别为100个小鼠MLD和300个小鼠MLD的类毒素。本试验结果为腐败梭菌疫苗的研制提供了重要的参考数据。

腐败梭菌；类毒素；免疫效果；含量

腐败梭菌（C.septicum）为革兰阳性杆菌，可引起人和动物的恶性水肿、肌肉坏死、气性坏疽及坏死性肠炎等疾病。该菌典型特征是在动物体内尤其是在肝被膜和腹膜上可形成长达数百μL的长丝［1-2］，在其所产生的α、β、γ、δ 4种外毒素中，α毒素是主要的致死性毒力因子［3-4］。羊经由消化道感染引起的羊快疫（Braxy）［5］，是一种常见多发非接触急性致死性传染病，以突然发病、病程很短、多呈急性死亡、真胃发生出血性炎症为主要特征。且发病羊多为育肥羊，给养羊业造成了很大的损失。免疫接种是预防该病的最为有效的途径之一，目前，我国用于预防羊快疫的疫苗主要有羊快疫、黑疫二联灭活疫苗、羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗、羊梭菌病多联干粉灭活苗等［6］。然而，笔者统计此类疫苗近8年来的检验结果发现，其合格率却不高。因此，为了确定腐败梭菌类毒素含量与免疫效果之间的关系，本试验以不同的类毒素含量分别接种家兔和绵羊，免疫后测定血清效价并进行攻毒，以期得到能使动物获得足够保护的抗原含量，为此类疫苗的研制、检验及提高疫苗质量奠定基础。

1　材料与方法

1.1菌株、培养基、溶液、试剂腐败梭菌C55-1（CVCC60021）株，由中国兽医药品监察所保存。腐败梭菌产毒培养基由本实验室自主研制，生理盐水、明胶缓冲液、葡萄糖溶液等参照《中国兽用生物制品规程》［2］配制。

1.2试验动物绵羊，5～6月龄，雄性，品种为藏羊和蒙古羊杂交系，购自甘肃张掖山丹军马场。CD-1（ICR）小鼠，体重16～20 g，SPF级；日本大耳白家兔，体重1.5～2.0 kg，清洁级，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3类毒素制备类毒素的含量用“每毫升含N个小鼠MLD”来表示。取种子接种腐败梭菌产毒培养基，培养完成后取样测定毒素对小鼠的致死量，剩余培养物加入甲醛灭活脱毒，灭活脱毒完成后3 000 r/min离心30 min，弃沉淀，加入灭菌铝胶、注射用水混匀，调pH值至6.5～7.0，使铝胶的终浓度为0.2 g/mL，使腐败梭菌类毒素的含量为200个小鼠MLD/mL，置2℃～8℃保存。

1.4腐败梭菌毒素对小鼠、家兔和绵羊的毒力测定取培养完成后的菌液，以30 00 r/min离心30 min，弃沉淀，上清用0.22 μm滤膜过滤，滤液即为毒素，分装成小份于试管中，-70℃保存。每次从冰箱中取出一支新毒素待冰融化后，用明胶缓冲液进行适当稀释，以不同滴度分别尾静脉注射小鼠、耳静脉注射家兔、颈静脉注射绵羊，每滴度注射2只，观察3日。能使动物2/2死亡的最小毒素量即为对该动物的最小致死量（MLD）。

1.5在家兔上类毒素含量与免疫效果之间的关系研究免疫前每只家兔采血5 mL，分离血清，按《中国兽药典》［6］的方法测定血清对腐败梭菌毒素的中和效价。血清效价是指“0.1 mL血清能中和的小鼠MLD数”。取制备好的腐败梭菌类毒素，分别以1.0 mL（200个小鼠MLD）、0.75 mL（150个小鼠MLD）、0.5 mL（100个小鼠MLD）和0.3 mL（60个小鼠MLD）的剂量肌肉注射家兔各4只，同时设未注射家兔2只作为空白对照。

1.5.1家兔血清中和效价测定免疫后17日，每只家兔耳动脉采血5 mL，分离血清，测定每组4只家兔混合血清对腐败梭菌毒素的中和效价。

1.5.2家兔攻毒保护试验免疫后21日，取各免疫组4只连同对照组2只家兔，每只各耳缘静脉注射1个家兔MLD毒素，观察5日。

1.6在绵羊上类毒素含量与免疫效果之间的关系研究免疫前每只绵羊采血10 mL，分离血清，按《中国兽药典》［6］的方法测定血清对腐败梭菌毒素的中和效价。血清效价是指“0.1 mL血清能中和的小鼠MLD数”。取制备好的腐败梭菌类毒素，分别以1.5 mL（300小鼠MLD）、1.0 mL（200小鼠MLD）和0.5 mL（100小鼠MLD）的剂量颈部肌肉注射绵羊各5只，同时设未注射绵羊5只作为空白对照。

1.6.1绵羊血清中和效价测定免疫后17日，每只绵羊颈静脉采血10 mL，分离血清，测定每只绵羊血清对腐败梭菌毒素的中和效价。

1.6.2绵羊攻毒保护试验免疫后21日，取各免疫组5只连同对照组5只绵羊，每只各颈静脉注射1个绵羊MLD毒素，观察5日。

2　结果

2.1腐败梭菌毒素的毒力测定将制备好的毒素稀释成不同滴度后分别静脉注射小鼠、家兔和绵羊，动物的死亡情况如表1所示。由此可知，1个小鼠MLD为0.004 mL的毒素原液，1个家兔小鼠MLD为0.12 mL的毒素原液（30个小鼠MLD），1个绵羊MLD为2.4 mL的毒素原液（600个小鼠MLD）。

2.2在家兔上类毒素含量与免疫效果之间的关系研究对免疫前家兔血清进行测定，结果效价均小于1，均为腐败梭菌毒素抗体阴性兔。将不同剂量的类毒素分别免疫家兔后，测定每组4只家兔混合血清对腐败梭菌毒素的中和效价，并用1个家兔MLD（0.12 mL）进行攻毒，结果（表2）表明，在一定范围内类毒素含量与免疫效果呈正相关，类毒素含量为100 MLD和150 MLD时的血清效价和攻毒保护率均最高。参考《中国兽药典》相关产品合格的标准“血清中和效价应达到1”和“对照组应2/2死亡，免疫组应至少3/4保护”可知，在家兔上血清效价和攻毒保护能同时满足标准要求的最小免疫量为100个小鼠MLD。

2.3在绵羊上类毒素含量与免疫效果之间的关系研究对免疫前绵羊血清进行测定，结果效价均小于1，均为腐败梭菌毒素抗体阴性羊。将不同剂量的类毒素分别免疫绵羊后，测定每只绵羊血清对腐败梭菌毒素的中和效价，并用1个绵羊MLD（2.4 mL）进行攻毒，结果（表3）表明，在一定范围内类毒素含量与免疫效果呈正相关，类毒素含量为300 MLD时的血清效价和攻毒保护率均最高。参考《中国兽药典》相关产品合格的标准“血清中和效价应达到1”和“对照组应2/2死亡，免疫组应至少3/4保护”可知，在绵羊上血清效价和攻毒保护能同时满足标准要求的最小免疫量为300个小鼠MLD。

表1　腐败梭菌毒素对小鼠、家兔和绵羊的毒力测定

表2　在家兔上类毒素含量与免疫效果之间的关系

3　讨论

目前，在用于预防羊快疫的疫苗中，以羊梭菌病多联干粉灭活疫苗、羊快疫、猝狙、肠毒血症三联灭活疫苗和羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗为主，近5年来这3种疫苗的总产量呈逐年增长的趋势，2014产量为2010年的2.4倍。然而，笔者对2006年至今该3种疫苗的效力检验结果进行统计，结果以血清中和法［6］检验为不符合规定的产品共有33批，其中腐败梭菌组分不符合规定的占15批（45.5%）。由此可见，腐败梭菌组分血清抗体效价不高是导致该类疫苗不符合规定的主要因素，已成为当前亟待解决的问题。

表3　在绵羊上类毒素含量与免疫效果之间的关系

参考《规程》［2］的制苗标准经计算可知，羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、肠毒血症三联四防灭活疫苗中所规定的接种家兔和羊的腐败梭菌类毒素含量分别为“至少62.4个小鼠MLD”和“至少104.2个小鼠MLD”。为了弄清楚究竟多大的抗原含量可提供足够的保护，本试验采用不同的类毒素含量免疫动物后测定血清效价并进行攻毒，结果表明，在家兔和绵羊上能提供保护的最小免疫剂量分别为100个小鼠MLD和300个小鼠MLD的类毒素。这似乎为解释“现有疫苗效力检验合格率不高”提供了一定的依据，即现有疫苗中腐败梭菌组分的抗原含量可能并不足够。尤为值得注意的是，本试验的数据是用腐败梭菌单组分灭活苗所获得的最小免疫剂量结果，而将该剂量用在三联苗甚至更多联苗中，其能否诱发机体提供足够的保护尚是未知数，仍需要进一步的试验来证实。本试验结果亦表明，在一定范围内类毒素含量与免疫效果呈正相关。因此，为解决目前传统灭活疫苗效力检验合格率不高的问题，提高类毒素的抗原含量显然是提高疫苗免疫效果的有效途径之一。另一方面，Amimoto K等［7］的研究结果表明，在豚鼠上腐败梭菌α类毒素在抵抗芽孢攻击方面发挥了重要的作用。进而，重组表达腐败梭菌梭菌α毒素基因［8-9］，也可能成为解决现有疫苗质量不高的另一候选途径。

此外，家兔是快疫类疫苗效力检验用动物，绵羊为疫苗使用的靶动物，然而《规程》［2］和《菌种目录》［10］仅给出了腐败梭菌对小鼠的毒力数据。本试验对腐败梭菌毒素在家兔和绵羊上的毒力进行了测定，补充了腐败梭菌疫苗生产检验用菌株的毒力数据。

本试验首次同时用血清中和法和免疫攻毒法，在家兔和绵羊上对腐败梭菌类毒素含量和免疫效果之间的关系进行了研究，确定了各自的最小免疫保护剂量，为腐败梭菌疫苗的研制提供了重要的基础性参考数据。

［1］陆承平.兽医微生物学［M］.北京：中国农业出版社，2013：194-196.

［2］农业部兽用生物制品规程委员会编.中华人民共和国兽用生物制品规程二○○○版［S］.北京：化学工业出版社，2000.

［3］Kennedy C L，Krejany E O，Young L F，et al.The alpha-toxin of Clostridium septicum is essential for virulence［J］.Mol Microbiol， 2005，57（5）：1357-1366.

［4］Kennedy C L，Lyras D，Cordner L M，et al.Pore-forming activity of alpha-toxin is essential for Clostridium septicum-mediated myonecrosis［J］.Infect Immun，2009，77（3）：943-951.

［5］Rodney K.Tweten.Clostridium perfringens beta toxin and Clostridium septicum alpha toxin their mechanisms and possible role in pathogenesis［J］.Vet Microbiol，2001，82：1-9.

［6］中国兽药典委员会编.中华人民共和国兽药典二○一○年版三部［S］.北京：中国农业出版社，2011.

［7］Amimoto K，Ohgitani T，Sasaki O，et al.Protective effect of Clostridium septicum alpha-toxoid vaccine against challenge with spores in guinea pigs［J］.J Vet Med Sci，2002，64（1）：67-69.

［8］张燕，边艳青，赵宝华.腐败梭菌α毒素基因的克隆表达及其类毒素的免疫原性研究［J］.生物工程学报，2007，23（1）：67-72.

［9］彭国瑞.重组腐败梭菌α毒素的免疫原性研究［D］.北京：中国兽医药品监察所，2014.

［10］中国兽医药品监察所，中国兽医微生物菌种保藏管理中心编.中国兽医菌种目录［S］.北京：中国农业科学技术出版社，2002.

Study on Relationship between Antigenic Amount ofClostridium SepticumToxoid and its ImmuneEffect

PENG Xiao-bing1，LI Xu-ni1，JIANG Yu-wen1，ZHANG Ai-min2，YU Hong-lei3，LUO Xian-yi2，CHEN Hong3，ZHENG Ming-ju2，SHEN Fang2，ZHAO Hai-yuan3
（1.China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China；2.Lanzhou Bio-pharmaceutical Factory of China Animal Husbandry Industry CO.，Ltd，Lanzhou 730046，China；3.Xinjiang Tecon Animal Husbandry Bio-technology Co.，Ltd，Urumqi 830032，China）

In order to determine the relationship between the vaccinated amount of Clostridium septicum toxoid and its immune effect，we vaccinated rabbits and sheep with various toxoid doses respectively.Seventeen days later，serum neutralization titers were analyzed and animals were challenged with MLD toxin.The results of virulence measurement showed that the toxin amount of one rabbit MLD was 30 times of that of one mouse MLD and the toxin amount of one sheep MLD was 600 times of that of one mouse MLD.The results of serum neutralization test and challenge protective test indicated that there was a positive correlation to a certain extent between the vaccinated toxoid amount and its immune effect，and the minimum protective dose for rabbit and sheep was 100 and 300 mouse MLD toxoid respectively.Our results provided important and basic reference data for study and development of Clostridium septicum vaccine.

Clostridium septicum；toxoid；immune effect；amount

JIANG Yu-wen

S852.61

A

0529-6005（2016）04-0006-03

2015-03-06

动物生物制品国家工程研究中心项目

彭小兵（1983-），男，助理研究员，硕士，主要从事生物制品研发和检验方法研究工作，E-mail：673303882@qq.com

蒋玉文，E-mail：jiangyuwen@ivdc.org.cn