Nalp3 MDA5和TLR7受体在青年鸡组织中的表达水平

陈海云，贾丽娟，单文杰，杨　旭，刘雪兰

Nalp3 MDA5和TLR7受体在青年鸡组织中的表达水平

陈海云，贾丽娟，单文杰，杨旭，刘雪兰

（安徽农业大学动物科技学院 人兽共患病重点实验室，安徽 合肥 230036）

天然免疫受体在机体抗病毒过程中发挥着重要作用。为了解Nalp3、MDA5和TLR7受体在青年鸡组织中分布特征，首先应用RT-PCR方法从18周龄鸡肝脏中分别扩增目的片段，建立实时荧光相对定量RT-PCR检测多种组织中Nalp3、MDA5和TLR7受体的表达谱及相对含量。结果表明，3种受体在不同组织中转录水平差异较大，其中Nalp3在肝脏和肾脏、TLR7在心、脾和肺脏中表达量相对较高，而MDA5在各组织中表达均较低。该3种受体在不同组织中转录水平的差异提示其识别的相对作用可能不同。

病毒RNA受体；mRNA转录水平；相对定量；组织分布特征

天然免疫在识别各种病原体感染以及随后触发获得性免疫应答过程中发挥至关重要的作用［1］。天然免疫识别受体中TLR7已被证实能识别病毒RNA，介导多种病毒的免疫应答［2］。除此之外，有研究发现，MDA5可识别单股正链RNA病毒［3］。Nalp3受体在HIV和流感病毒感染后激活下游信号通路［4-6］。相比哺乳动物，禽类天然免疫受体及其激活通路的探讨明显滞后，尤其是禽类Nalp3的相关研究更少，尚未建立有效的检测方法。为了解TLR7、MDA5和Nalp3等识别RNA病毒的天然受体在鸡体内的表达水平及其组织分布特征，本文从鸡肝脏组织中分别扩增出这3种受体的基因片段，建立实时荧光相对定量RT-PCR方法用于检测这3种不同受体鸡同一组织以及同一受体在不同组织中表达水平，为进一步探讨该类受体在鸡抗病毒作用提供研究基础。

1　材料与方法

1.1主要试剂及仪器RNA样本保存液、总RNA提取试剂，购自天根生化科技（北京）有限公司；荧光定量检测试剂盒、反转录试剂盒等，购自Ta-KaRa公司；Real Time PCR仪为ABI7500。

1.2引物设计及合成在参考GenBank上鸡TLR7、Nalp3和MDA5基因序列设计3对引物（见表1），扩增β-actin的引物参考文献［7］，送Invitrogen公司合成。

1.3Total RNA的提取及反转录无菌采集4只18周龄SPF鸡（购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，饲养在严格消毒的环境里），心、肝、脾、肺、肾和肌肉组织，储存于RNAStore中，然后提取各组织总RNA，去基因组和反转录成cDNA，-80℃保存备用。

表1　Nalp3、MDA5、TLR7实时定量PCR的引物设计

1.4目的基因的扩增、克隆及鉴定PCR反应程序为：94℃预变性4 min；98℃10 s，（51℃～60℃）30 s，72℃30 s，30个循环；72℃延伸5 min，4℃终止反应。经1.5%琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，与pMD18-T载体4℃过夜连接，转化DH5α感受态细胞，通过Amp+LB平板37℃过夜培养，挑单菌落培养后提取质粒，PCR鉴定为阳性后送Invitrogen公司测序。

1.5绘制标准曲线和相对定量检测分别以目的基因和内参基因的重组质粒为模板以10倍梯度稀释后进行实时荧光定量PCR，获得扩增各基因的标准曲线，通过溶解曲线分析扩增的特异性、扩增效率E值，并进行优化。实时荧光定量PCR反应程序：95℃30 s，95℃5 s，退火温度34 s，退火延伸时收集荧光信号。40个循环后进行溶解曲线分析，每个样品设3个重复，以检测各组织中Nalp3、MDA5、TLR7 mRNA的相对转录水平。

1.6数据分析采用相对比较Ct法（△△Ct）法分析相对定量结果。首先计算各组织样品中目的基因与内参基因Ct差值，然后以肌肉样品为对照，通过相对Ct值（△△Ct）计算公式：△△Ct=（Ct目的基因-Ct内参基因）实验组-（Ct目的基因-Ct内参基因）对照组，计算相对差异倍数，即QR=2-△△Ct，并进行统计学分析。

2　结果

2.1总RNA提取及目的基因PCR扩增的结果提取肝脏等组织总RNA反转录和PCR扩增，得到与预期大小相符的单一扩增条带（如图1所示），经测序Nalp3大小为126 bp，MDA5为309 bp，TLR7为225 bp，通过BLAST检索测序所得4个基因的序列均为鸡相对应的受体和内参序列。

图1　总RNA的提取及基因扩增的结果

2.2实时荧光定量PCR产物的特异性经溶解曲线分析Nalp3，MDA5，TLR7和内参基因β-actin的溶解温度Tm分别是83～84之间，均成单峰，无引物二聚体或其他杂峰，表明特异性较好。

2.3目的基因与内参基因的扩增效率通过仪器分析软件获得目的基因及内参基因的扩增效率 E值如下：ENalp3=110.385，EMDA5=103.087，ETLR7= 99.073，Eβ-actin=98.425，相应的扩增相关系数R2分别为0.987、0.990、0.995和0.997，表明Ct值与模板浓度的线性关系较好。

2.4Nalp3、MDA5、TLR7组织表达谱经检测Nalp3、MDA5、TLR7 mRNA在鸡不同组织器官的表达谱，如图4所示，相对肌肉组织，3种受体在心、肝、脾、肺和肾脏组织中表达变化较大，在心脏中未检测到Nalp3和MDA5。此外，Nalp3在肾脏、肝脏中相对表达量较高（P＜0.05），TLR7在心、脾和肺脏中表达量相对较高（P＜0.05），而MDA5在各组织中表达量均较低。

3　讨论

模式识别受体识别病原微生物的保守结构，在抗病原感染中发挥关键作用。TLR7主要识别经过内吞作用形成的病毒核酸成分。Cornelissen等发现，鸡巨噬细胞中TLR7在H9N2亚型禽流感病毒感染初期显著上调，而感染后期下降［8］。周作勇［9］和Mackinnon［10］分别报道了1日龄和2日龄雏鸡TLR3、TLR7和TLR21等在不同组织中转录水平差异较大。

图2　3种受体与内参基因相对定量PCR扩增的溶解曲线

图3　基因扩增标准曲线

图4　Nalp3、MDA5和TLR7 mRNA在不同组织中的相对表达水平

Gitlin等［11］证明，MDA5缺陷细胞在受到某些RNA病毒感染时，IFN-α和IFN-β产生的量明显减少。关于禽类MDA5主要集中于鸡和鹅［12］，Karpala等首次从鸡体内分离出MDA5基因，并发现MDA5在识别RNA病毒后可调节IFN-β的产生［13］。Nalp3通过识别流感病毒的RNA，诱导促炎细胞因子如IL-1β和IL-18的释放，在抗流感病毒和仙台病毒（SeV）中发挥着重要的作用［5-6］。

本文建立了同时，检测鸡3种受体的相对RT-qPCR方法，结果发现与雏鸡［9-10］相似，MDA5、Nalp3和TLR7受体尤其是后两者在青年鸡各个组织中表达水平变化较大，提示3种受体在病原体识别过程中的相对作用可能不同。此外，在非病原体感染诱导情况下，这3种受体在同一组织中相对表达水平差异也较大，提示除识别病原体外，可能还担负着其他功能，需进一步探讨。

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Tissue-sepecific mRNA Expression of Nalp3，MDA5 and TLR7 in Young Chicken

CHEN Hai-yun，JIA Li-juan，SHAN Wen-jie，YANG Xu，LIU Xue-lan

（College of Animal Science&Technology key laboratory of zoonoses，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

Innate immune receptor plays a major role in antiviral responses.Here，distributions of transcription of the pattern recognition receptors Nalp3，MDA5 and TLR7 in tissues were analyzed.The gene fragments of three receptor genes were amplified from young chicken livers with the specific primers.The quantitative real-time reverse transcription PCR（RT-qPCR）was established for the detection of the receptor mRNAS in different tissues of young chicken at the age of 18 weeks.The results showed that there were comparatively large differences in the transcription levels of three receptor mRNAS in different tissues.Nalp3 gene expression in the liver and kidney was relatively higher，and TLR7 expression in the heart，spleen and lung was relatively higher. However，MDA5 expression was very low in different tissues.Difference transcription levels of the three receptors may indicate that their differences reflect their relative roles in chicken.

immune receptors；mRNA transcription；RT-qPCR；tissue distribution

LIU Xue-lan

S852.4

A

0529-6005（2016）04-0019-03

2015-01-16

国家自然科学基金（31101846）

陈海云（1989-），男，硕士生，研究方向为动物微生物与免疫学，E-mail：602037349@qq.com

刘雪兰，E-mail：liuxuelan@ahau.edu.cn