棘腹蛙TNF α基因的克隆与序列分析

罗　洁，贺明淑，袁万安，樊汶樵，杨　帆，孙翰昌，徐敬明

（1.重庆文理学院林学与生命科学学院 重庆珍稀濒危水产资源保护与开发研究中心，重庆 永川 402168；2.重庆电信职业学院，重庆 永川 402160）

棘腹蛙TNF α基因的克隆与序列分析

罗洁1，贺明淑2，袁万安1，樊汶樵1，杨帆1，孙翰昌1，徐敬明1

（1.重庆文理学院林学与生命科学学院 重庆珍稀濒危水产资源保护与开发研究中心，重庆 永川 402168；2.重庆电信职业学院，重庆 永川 402160）

为了解棘腹蛙TNFα基因的相关信息，对棘腹蛙的TNFα基因进行了克隆和序列分析。克隆了全长为936 bp、ORF长度为675 bp的TNFα-Pb基因；对该基因的蛋白质结构分析显示，TNFα-Pb的信号肽由44个氨基酸组成，随后由2个α螺旋，和10个β折叠形成小分子蛋白；系统进化分析发现，TNFα-Pb与两栖类聚为一枝，与高等哺乳动物存在功能分化的可能。本研究为了解棘腹蛙的生物反应调节机制奠定了一定基础。

棘腹蛙；肿瘤坏死因子α；克隆；序列分析

肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）是一类介导免疫和炎症反应，促进细胞的增值与分化的多功能细胞因子［1］。该基因由TNFA和TNFB组成，并分别编码TNFα和TNFβ。其中，TNFα是由单核细胞和巨噬细胞产生的一种疏水性蛋白质，受体分布较广；因其能够选择性地引起肿瘤组织坏死，因此受到人们的广泛关注。人的TNFα基因长度约2.6 kbp，能够通过与细胞膜上的特异受体结合参与细胞的生长、分化、凋亡、诱发炎症甚至肿瘤疾病的治疗［2］，有关TNFα信号通路的研究成为近十年生物医学研究领域的热点。近几年，有研究TNFα可以通过激活下游信号转导通路，实现调节免疫反应、细胞凋亡、炎症应答以及肿瘤发生［3-4］。2015年初，中科院葛高翔等人分别解析了肿瘤坏死因子TNFα如何诱导癌细胞迁移和转移［5］。

棘腹蛙（Paa boulengeri），属于两栖纲，无尾目，蛙科；是我国特有的广泛分布于西南地区的土著大型蛙类。其体型硕大，肉质白嫩，能够治疗小儿虚瘦、产后或病后虚弱等症，具有广阔的市场前景。近年来，由于环境污染、气候的异常变化、人类的大肆捕杀等多种因素造成其种群数量的骤减，已被《中国濒危物种红皮书》列为“易危”物种。本研究通过对棘腹蛙肿瘤坏死因子基因（TNFα-Pb）的克隆和生物信息学分析，为探索棘腹蛙的生物反应调节机制奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1试验试剂和耗材2岁龄健康棘腹蛙，饲养于重庆珍稀濒危水产资源保护与开发研究中心两栖动物流水养殖系统。TRIZol、DEPC，购自上海生工生物工程技术服务有限公司；cDNA合成试剂盒、Taq酶、PCR纯化试剂盒，购自Promega公司；凝胶回收试剂盒，购自OMEGA公司；Trans2K DNA Marker，购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2特异引物的设计根据其转录组数据库，利用Primer5.0软件设计基因特异性引物，包括上游引物：5′-TGGACAAACCAACAGCAAACACACA-3′，下游引物：5′-AAGAACGTGAGCCGATGGAAAAACA-3′；由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

1.3棘腹蛙TNFα-Pb基因序列获得取棘腹蛙组织制备cDNA模板，并利用高保真DNA Taq酶进行特异基因的扩增，阳性产物交苏州金唯智生物科技有限公司测序。

1.4生物信息学分析使用SignalP 3.0，TMHMM，DNASTAR，SMART和Swissprot软件分别进行信号肽、跨膜域、同源比对、功能结构分析。利用MEGA 5.0软件以邻近法（Neighbor-Joining）取500次重复构建系统进化树。

2　结果与讨论

2.1TNFα-Pb基因的克隆根据棘腹蛙转录组数据库检索发现1个注释为TNFα-Pb的基因，利用RTPCR克隆了其全长序列。结果如图1所示，包括两端UTR区的TNFα-Pb基因总长为936 bp，其中包含1个675 bp的ORF，编码224个氨基酸，蛋白质理论分子量为25.08 kDa，等电点为7.16。

图1　TNFα-Pb的基因扩增及序列分析

2.2棘腹蛙TNFα-Pb的蛋白结构特征从中插彩版图2结果显示，棘腹蛙TNFα-Pb的二级结构显示，整个蛋白可能存在α螺旋的区域为氨基酸序列的24-48位和67-68位可能的β折叠区域分别为氨基酸序列的4-5位，88-95位，100-105位，116-119位，122-125位，131-139位，151-158位，184-194位，199-203位和217-223位。其中，1-44位存在信号肽，88-224位为保守的功能域。而以人的TNFα（3ALQ_A）为模板，利用Swissprot软件预测TNFα-Pb的三维结构可直观看出，棘腹蛙的TNFα-Pb为小分子蛋白，主要由2个α螺旋和10个β折叠组成，结构相对简单。

2.3TNFα-Pb的进化根据GenBank中搜索到113条TNFα-Pb的同源序列，利用邻接法构建遗传进化树。结果显示（图3），TNFα-Pb与两种爪蟾Xenopus laevis和Xenopus（Silurana）tropicalis聚为一簇，而后与脊索动物门的矛尾鱼亲缘关系较近，并与爬行类、哺乳类和鸟类形成不同分支，说明TNFα的进化相对稳定，为其起源和功能分化再一次提供了补充依据。

3　结论与讨论

肿瘤坏死因子α（TNFα）是由单核巨噬细胞产生，具有免疫应答、炎症反应、修复细胞损伤、参与细胞凋亡等生物学功能［6］，多在生物损伤和全身炎症反应综合征过程中发挥主要功能［7］。简单说来，TNFα一方面是机体的免疫防护的重要介质，例如，正常水平的TNFα主要作为炎症介质而作为疾病危重阶段的辅助诊断指标。另一方面可参与机体的免疫病理损伤，是免疫性疾病的发病的临床监测对象，例如，TNFα的高量表达可引发组织细胞损伤，被公认为是抗炎症和抗肿瘤作用最强的细胞因子［8］。但是，TNFα的功能分化机制至今尚未见报道。

图3　TNFα-Pb的系统进化树构建

本研究是基于对棘腹蛙的转录组数据分析过程中，首次鉴定到该物种的TNFα-Pb及其编码蛋白质的序列特征，并通过一系列分析为研究TNFα的功能分化提供了理论依据。序列特征分析结果显示，相较于人的TNFα，尽管二者在两端的非翻译区同样具有相对保守的AU富含元件，但棘腹蛙的TNFα-Pb的功能序列均更短，并且TNFα-Pb前体由223个氨基酸组成（25.08 kDa），其中包含44个氨基酸残基的信号肽。对应的蛋白质的三维结构也更加简单，主要为2个短的α螺旋和10个β折叠形成的β夹心结构。鉴于有报道称人的TNFα缺失N端2个氨基酸（Val、Arg）具有更好的生物学活性和抗肿瘤效应。因此，我们推测棘腹蛙TNFα-Pb与人TNFα的功能存在较大差异。通过邻接法构建的系统进化结果显示，TNFα-Pb的进化相对稳定，有意思的是，狐蝠科的3种蝙蝠与小耳大婴猴聚为一枝，并且与马属TNF-α近缘，其中前者置信值为51，视为亲缘较近，暗示该基因存在趋同进化趋势，并且存在功能分化的可能。因此，深入挖掘棘腹蛙TNFα-Pb的功能将有助我们进一步解析肿瘤坏死因子的分化历程，为阐释其生物学功能机制奠定基础。

［1］Tartaglia L A，Goeddel D V.Two TNF receptors［J］.Immunology today，1992，13：151-153.

［2］Tracey K J，Cerami A.Tumor necrosis factor:a pleiotropic cytokine and therapeutic target［J］.Annual review of medicine，1994，45：491-503.

［3］Liu J，Yan J，Jiang S，et al.Site-specific ubiquitination is required for relieving the transcription factor Miz1-mediated suppression on TNF-alpha-induced JNK activation and inflammation［J］.PNAS，2012，109：191-196.

［4］Yan J，Xiang J，Lin Y，et al.Inactivation of BAD by IKK inhibits TNFalpha-induced apoptosis independently of NF-kappaB activation［J］.Cell，2013，152：304-315.

［5］Xia P，Zhang R，Ge G C.EBPbeta Mediates TNF-alpha-Induced Cancer Cell Migration by Inducing MMP Expression Dependent on p38 MAPK［J］.Journal of cellular biochemistry，2015，116：2766-2777.

［6］Chen J W，Chen Y H，Lin S J.Long-term exposure to oxidized low-density lipoprotein enhances tumor necrosis factor-alphastimulated endothelial adhesiveness of monocytes by activating superoxide generation and redox-sensitive pathways［J］.Free radical biology medicine，2006，40：817-826.

［7］Wilson M R，Choudhury S，Takata M.Pulmonary inflammation induced by high-stretch ventilation is mediated by tumor necrosis factor signaling in mice［J］.American journal of physiology Lung cellular and molecular physiology，2005，288：599-607.

［8］Murano M，Maemura K，Hirata I，et al.Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B（p65）antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium（DSS）-induced colitis［J］.Clinical and experimental immunology，2000，120：51-58.

Molecular cloning and analysis of Tumor Necrosis Factor alpha（TNFα）fromPaa boulengeri

LUO Jie1，HE Ming-shu2，YUAN Wan-an1，FAN Wen-qiao1，YANG Fan1，SUN Han-chang1，XU Jing-ming1
（1.College of Life Science&Forestry Chongqing University of Art&Science Chongqing Chongqing Research Centers of Conservation and Development on Rare&Endangered Aquatic Resources，Chongqing 402168，China；2.Chongqing electronic information college，Chongqing 402160，China）

Tumor necrosis factor alpha（TNFα）is a cytokine involved in immune regulation，apoptosis，and inflammation pathways.Here，we studied the sequence feature，protein structure and phylogenic characteristic of TNFα from Paa boulengeri，The results showed that，TNFd-pb gene was 936 bp in length and the protein structure of TNFα-Pb was a small molecular protein that consisted of 44 amino acid length of signal peptide，two alpha helixes and ten beta sheets.And the phylogenic analysis showed that TNFα-Pb was in the cluster with other amphibian but may have different functions when compared with mammals.Hence，this study may lay the foundation to reveal the immune-regulation mechanism of Paa boulengeri in future.

Paa boulengeri；Tumor Necrosis Factor alpha（TNFα）；Cloning；Sequence analysis

YANG Fan

R 394.2

A

0529-6005（2016）04-0009-04

2015-11-26

重庆市科技计划重点专项（cstc2015jcyjBX0013）；重庆市科技计划项目（cstc2014jcyjA80042）；重庆市教委科学技术研究项目（KJ1401105）；重庆文理学院人才引进项目（R2013LS13，R2014LX07）

罗洁（1983-），女，讲师，博士，从事比较基因组学研究，E-mail：eijoul@sina.cn

杨帆，E-mail：yfan4103@163.com