基于SELDI-TOF-MS技术的奶牛乳热血浆蛋白质组学分析

舒　适，夏　成，张洪友，许楚楚，李昌盛，肖鑫焕，王　刚

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

基于SELDI-TOF-MS技术的奶牛乳热血浆蛋白质组学分析

舒适，夏成，张洪友，许楚楚，李昌盛，肖鑫焕，王刚

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江 大庆 163319）

奶牛乳热是围产期奶牛营养代谢性疾病，对于奶牛乳热在病理方面少有血浆蛋白质组学的研究。本研究目的是探究奶牛乳热在蛋白质组学层面的变化。试验21头患有奶牛乳热的奶牛和59头健康奶牛作为试验动物。试验通过SELDI-TOF-MS技术检验得到24个差异肽段的峰值，其中10个肽段经过Swissport Protein数据库搜索鉴定为10种差异蛋白。结果相对于对照组，乳热组中表达上调的蛋白4个；表达下调的蛋白2个；还有既表达上调又表达下调的蛋白4个。结论本次试验应用SELDI-TOF-MS技术鉴定了几个在奶牛发生乳热时表达的差异蛋白质。这些发现也为以后揭示奶牛乳热代谢性改变提供了依据。

SELDI-TOF-MS技术；蛋白质组学；乳热；奶牛

奶牛乳热是高产奶牛常发的一种代谢性疾病。乳热能引起患病奶牛发生某些重要的疾病，如乳腺炎，酮病，胎衣不下，真胃变位以及子宫脱出等。奶牛乳热以低钙血症为特征，当奶牛血钙浓度降低时，机体将通过增加甲状旁腺素分泌和1，25二羟维生素D3生成来调控血钙水平［1］。

表面增强激光解析/电离飞行时间质谱（SELDITOF-MS）是一种新发展的蛋白质组学技术。与传统的荧光双向凝胶电泳相比，SELDI-TOF-MS可以应用不同的色谱层析表面来运送蛋白点，并且具有操作简便、耗时短、寻找差异蛋白广泛的优点［2］。近年来，SELDI-TOF-MS技术广泛应用于乳腺癌、严重急性呼吸系统综合征以及药物发现的研究。

有关奶牛乳热发生的病因学涉及生理、生化、病理等多方面应用SELDI蛋白芯片的方法探索该病的研究少有报道。本研究目的在于应用SELDI技术进一步从蛋白组学角度探索奶牛乳热发生时机体可能出现功能变化。

1　材料与方法

1.1试验动物在黑龙江某集约化养牛场选取荷斯坦奶牛80头作为试验动物，根据其血钙浓度和临床表现将其分为乳热组（T，Ca＜1.50 mmol/L和明显临床症状）和健康对照组（C，Ca＞2.20 mmol/L和无临床症状）（表1）。

表1　试验奶牛的年龄、胎次和血钙平均水平（平均值±标准差）

1.2血浆检测在患病和正常奶牛分娩当天6 h内，尾静脉采血10 mL。肝素抗凝，迅速离心（3 000 r/min离心5 min）分离血浆，置于-80℃冰箱冷冻保存。应用全自动生化分析仪（modullarDPP，德国罗氏），血浆钙试剂盒（651564-01，德国罗氏）检测。

1.3SELDI-TOF-MS试验

1.3.1样品处理-80℃冰箱中取出血清样品冰盒上融解，10 000 r/min（4℃）离心5 min；每个芯片点需要奶牛血清10 μL，将血清用1倍体积U9缓冲液稀释，冰浴振荡30 min；将20 μL样品加入180 μL相应的CM10结合缓冲液，混匀后上样到芯片上。

1.3.2芯片处理芯片每孔加入10 Mm HCl 5 μL放入湿盒中清洗5 min，洗涤后弃去液体加入5 μL HPLC级超纯水震摇洗涤5 min；CM10蛋白芯片每孔加入100 μL洗脱缓冲液室温剧摇孵育5 min；弃去洗脱缓冲液加入100 μL样品，剧摇孵育60 min。弃去样品加入100 μL洗脱缓冲液室温剧摇孵育5 min后弃去洗脱缓冲液，每孔加入100 μL HPLC级超纯水震摇洗涤5 min；弃去水溶液，将芯片取出干燥10～15 min，SELDI上分析蛋白芯片。

2　结果

2.1SELDI-TOF-MS检测结果以及预测蛋白通过Ciphergen ProteinChip软件对在两组差异峰图进行分析。将两组之间的数据峰值做Wilcoxon统计检验。筛选出P值小于0.01的差异峰，并获得了37个差异峰。并选取预测蛋白结果中差异最显著的点，即m/z为3898.65点，通过Trace view和Gel view分别展示（见中插彩版图1）。

在得到的37个差异峰中，经Swissport蛋白数据库检索蛋白作为差异峰可能的蛋白预测结果。获得24个可预测的差异峰（P＜0.01），预测蛋白10种。相对于C组，在T组中有4个蛋白表达上调（补体蛋白c3，淀粉样蛋白βA4蛋白，血清蛋白，海帕西啶），2个蛋白表达下调（血浆蛋白酶c1抑制剂，载脂蛋白A2）和4个蛋白既表达上调又表达下调（纤维蛋白原α链，VGF，血清淀粉样蛋白α，胱抑素c）。

2.2生物信息学分析应用Cytoscape软件对实验结果的10种蛋白进行牛类基因网络搜索，并得到Networks分析结果图，数据库来源于网络软件STRING。根据搜索结果，本试验有6种蛋白质可在数据库中搜索得到结果，分别是HAMP，SAA1，ALB，C3，CST3和APP。并得到其相关的Networks分析结果，见中插彩版图2。

3　讨论

本试验在T组获得了4个表达上调的蛋白，2个表达下调的蛋白，以及4个既表达上调，又表达下调的蛋白。

首先，4个表达上调的蛋白分别是complement c3 frag、amyloid beta a4 protein、serum albumin frag、hepcidin。当奶牛发生乳热时，免疫细胞对刺激的敏感性降低，可导致炎症反应。本试验结果显示，由炎症活化巨噬细胞分泌的一种在免疫系统中具有中心作用的C3补体片段和能够通过铁加载和激活炎症反应的海帕西啶［3］均在乳热组表达上调，提示在乳热发生过程中，补体系统发挥作用以提高机体免疫防御功能，但是否与海帕西啶有关尚不知晓。另外，β淀粉样蛋白表达上调产生神经毒素而导致老年痴呆症，乳热奶牛时常表现精神沉郁和瘫痪等症状，是否与它有关需要进一步证实。虽然血清白蛋白与奶牛乳热发生的关系未见报道，但本试验的结果对两者关系研究提供了实验依据。

其次，2个表达下调的蛋白：plasma protease c1 inhibitor frag、apolipoprotein a-2。C1抑制剂作为炎症反应重要的抑制剂［4］，在乳热奶牛炎性疾病发生时，其表达下调，表明未发挥其抑制炎症的作用。近期的研究表明，载脂蛋白（ApoA-II）与心血管疾病有关，它可以运载一些蛋白来抵抗这种疾病。当ApoA-II表达下调时，可引发心血管疾病，提示可能与奶牛发生乳热时出现心动过速，心律不齐有关。C1抑制剂和ApoA-II与乳热奶牛的关系也需要进一步验证。

此外，4个即表达上调，又表达下调的蛋白。

纤维蛋白原转变成纤维蛋白是凝血过程中一个重要的过程［5］，而Ca2+在这个过程中起到促进作用。纤维蛋白原表达上调可能与奶牛乳热继发的炎症反应相关；而纤维蛋白原表达下调则可能与血液凝固通路有关，纤维蛋白原大部分转化成纤维蛋白，同时消耗大量的Ca2+，可能是血浆钙浓度降低的一个因素。这也与之前C1抑制剂促进凝血的观点相一致。

当机体发生神经受损、炎症反应时，VGF会表达上调［6］。而当机体发生老年痴呆症都会引起VGF的下调［7］。与上述结论相同，VGF的表达上调可能与乳热奶牛的炎症反应相关；而VGF表达下调则与β淀粉样蛋白表达上调引起老年痴呆症，可能与奶牛表现精神沉郁有关，但是仍需要进一步研究。

SAA可增加HDL分解代谢，降低血清胆固醇脂化、改变HDL分布［8］。SAA表达上调可能与奶牛发生乳热后，机体继发感染的时间有关；而SAA表达下调可使HDL分解代谢降低，这也与上述Apo-AII表达下调的结果相一致。

奶牛乳热发生时，机体免疫力下降，这可能与胱抑素C表达上调使免疫应答受阻相关；血浆钙浓度降低是奶牛乳热的一个重要标志指标，而当血浆钙浓度降低时，正常机体会使肾脏对Ca2+的重吸收增加，以恢复血浆钙浓度，而患病时，胱抑素C表达下调直接反映肾小球滤过率降低［9］，这可能与肾脏对Ca2+重吸收未发挥作用有关。

这4种蛋白质在本试验中既表达上调又表达下调，可能与蛋白质本身参与的生理病理过程有关，奶牛发生乳热时引起这些蛋白上、下调的同时变化的现象，值得进一步探究。

总之，本试验首次应用SELDI-TOF-MS技术研究奶牛乳热血浆蛋白质组学，成功预测了10种蛋白质并发现其发生了改变，这可能与奶牛乳热发生和发展有关，这为今后深入研究这10种蛋白与奶牛乳热发生的关系奠定了基础。

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［2］Roland Lehmann，Christian Melle，Niko Escher，et al.Detection and identification of protein interactions of S100 proteins by ProteinChip technology［J］.Journal of Proteome Research，2005，4（5）：1717-1721

［3］Daniel W.Coyne.Hepcidin:clinical utility as a diagnostic tool and therapeutic target［J］.Kidney International，2011，80（3）：240-244

［4］J Jackson，R B Sim，K Whaley，et al.Autoantibody facilitated cleavage of C1-inhibitor in autoimmune angioedma［J］.J Clin Incest，1989，83（2）：698-707.

［5］Gary O’Donovan，Edward Kearney，Roy Sherwood，et al.Fatness，fitness，and cardiometabolic risk factors in middle-aged white men［J］.Metabolism-Clinical and Experimental，2012，61（2）：213-220.

［6］Maureen S，Riedl，Patrick D.Braun，et al.Proteomic analysis uncovers novel actions of the neurosecretory protein VGF in nociceptive processing［J］.J Neurosci，2009，29（42）：13377-13388.

［7］Stephen R J Salton.Gian-Luca Ferri，Seung Hahm，et al.VGF：A novel role for this neuronal and neuroendocrine polypeptide in the regulation of energy balance［J］.Frontiers in Neuroendocrinology，2000，21（3）：199-219.

［8］Salazar A，Pintó X，Mana J，et al.Serum amyloid A and highdensity lipoprotein cholesterol：serum markers of inflammation in sarcoidosis and other systemic disorders［J］.European Journal of Clinical Investigation，2001，31（12）：1070-1077.

［9］Nevio Taglieri，Wolfgang Koenig，and Juan Carlos Kaski.Cystatin C and cardiovascular risk［J］.Clinical Chemistry，2009，55（11）：1932-1943.

Plasma Proteomics Analysis of Dairy Cows with Milk Fever Using SELDI-TOF-MS

SHU Shi，XIA Cheng，ZHANG Hong-you，XU Chu-chu，LI Chang-sheng，XIAO Xin-huan，WANG Gang
（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Milk fever is an important metabolic disorder of dairy cows at calving.There have been many studies on the pathophysiology of milk fever，but the plasma proteomics of milk fever has not been reported.The aim of this study was to investigate novel changes in the plasma proteomics of cows with milk fever.Plasma samples were obtained from 21 Holstein cows with milk fever（T），and 59 control Holstein cows without milk fever（C）.24 differential peptide peaks in the plasma of T and C cows were isolated by SELDI-TOF-MS.10 of these peaks were identified by Swissport Protein Database.The petide peaks represented 10 unique proteins，and had significant alterations in peaks as determined.The up-regulated proteins were 4，and the down-regulated proteins were 2.The other proteins which were up-regulated as well as down-regulated were 4.In conclusion，we were able to use SELDI-TOF-MS to identify several novel plasma proteins in cows with milk fever.These findings may reveal new metabolitechanges in cows with milk fever.

SELDI-TOF-MS；plasma proteomics；milk fever；dairy cows

XIA Cheng

S858.23

A

0529-6005（2016）04-0016-03

2014-11-21

国家自然科学基金项目主任基金（30840060）；国家自然科学基金面上项目（30972235）；黑龙江省自然科学基金面上项目（C200916）

舒适（1986-），女，博士生，研究方向为临床兽医学专业动物营养代谢病，E-mail：519296311@qq.com

夏成，E-mail：xcwlxyf@sohu.com