复方甘草酸苷注射液对B16鼠黑素瘤细胞黑素生成的影响

颜克香 祝绿川 郑志忠

·论著·

复方甘草酸苷注射液对B16鼠黑素瘤细胞黑素生成的影响

颜克香 祝绿川 郑志忠

目的： 研究复方甘草酸苷注射液对B16鼠黑素瘤细胞黑素的影响及其机制。方法： 通过CCK8、流式细胞术、NaOH裂解法、多巴氧化法和Western-blotting技术检测复方甘草酸苷对B16鼠黑素瘤细胞生长，黑素合成与转运及酪氨酸酶活性和蛋白含量的影响。结果： （1）复方甘草酸苷注射液浓度低于30 μL/mL，对B16鼠黑素瘤细胞生长无明显影响；浓度大于50 μL/mL，细胞生长速率减慢；浓度达到500 μL/mL，细胞生长明显受抑制。（2）浓度在10 μL/mL到200 μL/mL，黑素的合成和酪氨酸酶的活性均增加。黑素的合成在复方甘草酸苷注射液浓度为50 μL/mL时增加最明显；且酪氨酸酶活性呈浓度依赖性增加，在浓度为100 μL/mL和150 μL/mL时达到最高。结论： 复方甘草酸苷注射液有促进黑素瘤细胞黑素的合成与转运及增加酪氨酸酶活性的作用。

复方甘草酸苷； B16鼠黑素瘤细胞； 酪氨酸酶

临床上我们发现用复方甘草酸苷联合其它治疗白癜风的药物可明显加快白斑皮损处色素的恢复，控制活动期皮损的发展，国内学者也有报道复方甘草酸苷可增加外用药物如复方卡力孜然酊、卤米松等的疗效［1，2］，与其它药物联合运用的治疗效果要优于泼尼松［3］。但复方甘草酸苷治疗白癜风的理论机制还未见相关报道，因此，我们体外研究不同浓度复方甘草酸苷对B16鼠黑素瘤细胞的生长、黑素合成与转运及酪氨酸酶活性的影响，探讨复方甘草酸苷治疗白癜风的作用机制，为临床治疗白癜风提供理论依据。

1　材料与方法

1.1材料 主要试剂:B16鼠黑素瘤细胞由中科院提供，Hacat细胞由本室冻存，RPMI 1640培养基（美国，Gibco公司），新生小牛血清（Hyclone），左旋多巴（L-dopa），胰蛋白酶为Sigma产品，CCK-8（同仁化学研究所），复方甘草酸苷注射液（日本米诺公司提供），Fix&Perm破膜试剂盒（invitrogen公司），PE-cytokeratin（abcam公司），兔抗人的酪氨酸酶抗体（abcam公司），CFDA-SE（碧云天）。

1.2实验方法

1.2.1B16鼠黑素瘤细胞的培养 用含10%新生牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基置37℃、5%CO2培养箱中进行培养，待细胞生长至近融合状态，经含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，制备细胞悬液和台盼蓝染色计活细胞数，然后进行实验，每一次实验均取自同一传代细胞，每次实验重复三次。

1.2.2B16鼠黑素瘤细胞增殖率的测定 取对数生长期B16鼠黑素瘤细胞，经胰酶消化制备单细胞悬液，以 5×103/孔接种至96孔培养板，置37℃、5% CO2培养箱中进行培养，孵育6～12 h待细胞贴壁后，实验组加入不同浓度的复方甘草酸苷注射液（1 μL/ mL，5 μL/mL，10 μL/mL，30 μL/mL，50 μL/mL，100 μL/mL，200 μL/mL，500 μL/mL），每种浓度设3个复孔，同时设只含培养液而无细胞的空白组和有细胞不加药物的对照组，分别于加药后24 h，48 h，72 h，96 h，120 h加入CCK-8 10 μL，置CO2培养箱继续培养4 h，然后用酶标仪检测450 nm的吸光度值，参考波长是650 nm，用下列公式计算各组细胞增殖率，细胞增殖率=（实验组 A450-空白组 A450）/（对照组A450-空白组A450）×100。

1.2.3酪氨酸酶活性和黑素含量测定 取对数生长期B16鼠黑素瘤细胞，经胰酶消化后以1×105/孔接种至6孔培养板，待细胞贴壁后加入不同浓度的复方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培养箱继续培养72 h，经胰酶消化后计数，用NaOH裂解法测定黑素含量［4］，多巴氧化法测定酪氨酸酶的活性［5］，并加以修改。

1.2.4B16鼠黑素瘤细胞酪氨酸酶蛋白的测定 取对数生长期B16鼠黑素瘤细胞，经胰酶消化后以1× 106接种至直径6 cm的培养皿，待细胞贴壁后加入不同浓度的复方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/ mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培养箱继续培养72 h，用全细胞裂解液提蛋白，并用Brodford法测定蛋白浓度，取相同蛋白浓度的样品热变性后上样，经10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭后先后加入一抗（1∶1000）和相应的二抗孵育，plusECL化学发光检测酪氨酸酶和β-actin蛋白的表达，应用化学发光成像分析仪对图像进行分析。

1.2.5B16鼠黑素瘤细胞黑素转运的测定 取2×106B16鼠黑素瘤细胞用CFDA-SE标记（按说明书操作），将标记后的B16鼠黑素瘤细胞和Hacat细胞以1∶2的比例接种于直径3 cm的培养皿，并设立单独培养的对照组，待细胞培养24 h后加入不同浓度的复方甘草酸苷注射液（0 μl/mL，10 μl/mL，30 μl/mL，50 μl/mL，75 μl/mL，100 μl/mL，150 μl/mL，200 μl/mL，500 μl/mL），置CO2培养箱继续培养96 h，将细胞用胰酶完全消化下来后，用PBS洗涤2次，分别加入试剂A和试剂B（按说明书操作）对细胞进行固定和通透后加入20 μL PE-cytokeratin，室温孵育1 h，用含5%FBS的PBS洗涤3次后上流式检测PE阳性的Hacat细胞中CFDA-SE标记阳性的细胞数，即代表成功发生黑素转运的Hacat细胞数目。

2　结果

2.1不同浓度的复方甘草酸苷对B16鼠黑素瘤细胞形态的影响:复方甘草酸苷浓度大于50 μl/mL时，B16鼠黑素瘤细胞开始出现形态学的改变，主要表现为细胞胞体变大，树突增多，以200 μl/mL时最明显，见图1、2

2.2不同浓度的复方甘草酸苷对B16鼠黑素瘤细胞增殖率的影响:当复方甘草酸苷浓度在30 μl/mL以内时，对B16鼠黑素瘤细胞生长无明显影响；浓度大于50 μl/mL时，细胞生长速率开始减慢，到达平台期的时间延长，当浓度达到500 μl/mL时，细胞生长明显受抑制，见表1。

图1　对照组

图2　200 μl/mL组

表1　不同浓度的复方甘草酸苷对B16鼠黑素瘤细胞增殖的影响

2.3不同浓度复方甘草酸苷对B16鼠黑素瘤细胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影响:当复方甘草酸苷浓度在10 μl/mL到200 μl/mL时，黑素的合成和酪氨酸酶的活性均增加。黑素的合成在浓度为50 μl/mL时增加最明显；酪氨酸酶活性呈浓度依赖性增加，在浓度为100 μl/mL和150 μl/mL时达到最高，见图3。

图3　不同浓度复方甘草酸苷对B16鼠黑素瘤细胞黑素合成及酪氨酸酶活性的影响

2.4不同浓度复方甘草酸苷对B16鼠黑素瘤细胞酪氨酸蛋白表达的影响:当复方甘草酸苷浓度在30 μl/ mL和50 μl/mL时酪氨酸蛋白表达明显增加，浓度大于75 μl/mL时，酪氨酸蛋白表达降低，当浓度达到500 μl/mL，酪氨酸蛋白表达明显受抑制，见图4。

图4　不同浓度的复方甘草酸苷对酪氨酸蛋白表达的影响

2.5不同浓度复方甘草酸苷对B16鼠黑素瘤细胞向Hacat细胞转运黑素的影响:复方甘草酸苷浓度在10 μl/mL～200 μl/mL之间时均有促进黑素转运的作用，以浓度为75 μl/mL和150 μl/mL时，黑素转运能力最强，无明显的剂量相关性，见图5。

图5　不同浓度复方甘草酸苷对B16鼠黑素瘤细胞向Hacat细胞转运黑素的影响

3　讨论

早在1987年就有学者发现甘草次酸抑制B16黑素瘤细胞生长，并导致细胞形态的改变和刺激黑素的合成，甘草酸苷也可导致同样的改变但需要的浓度比甘草次酸高20多倍，甘草次酸处理细胞84 h后除去，细胞的生长速率可轻度恢复，但倍增时间是对照组的2倍，流式细胞术检测发现甘草次酸对细胞生长的抑制是通过阻止细胞由G1期进入S期造成的［6］。我们的结果表明复方甘草酸苷浓度大于50 μl/mL时，B16鼠黑素瘤细胞生长速率开始减慢，进入平台生长期的时间延长，这可能也与阻止细胞由G1期进入S期有关。随着复方甘草酸苷浓度的增加，细胞形态学的改变也越明显，主要表现为胞体增大，树突增多，以浓度为200 μl/mL最明显；当浓度达到500 μl/mL时，细胞胞体又开始变小，树突也减少。

Jung等研究证实甘草酸苷可以剂量依赖性方式促进B16黑素瘤细胞内酪氨酸酶mRNA和蛋白的表达，增加酪氨酸酶的活性及黑素的含量。酪氨酸相关蛋白2（TRP-2）mRNA水平也增加，而酪氨酸相关蛋白1（TRP-1）的变化不明显。在甘草酸苷的有效浓度内没有出现细胞毒性，而在同样无毒性浓度下，甘草次酸对黑素合成无明显影响［7］。这与1987年Abe等报道的甘草次酸能刺激黑素的合成不一致，分析原因可能与两者的浓度不一样有关:Jung等的研究是在对细胞无毒性的条件下进行，而Abe等的研究是在使细胞形态发生改变的条件下进行。虽然1分子的甘草酸苷含1分子的甘草次酸和2分子的葡萄醛酸，但相同剂量的甘草次酸不能增加酪氨酸酶mRNA和蛋白水平，对黑素合成无影响，这表明甘草酸苷中的糖苷结构在黑素合成过程中起重要作用。本研究中发现复方甘草酸苷浓度在30 μl/mL和50 μl/mL时，酪氨酸酶蛋白表达增加，黑素的合成也增加，并在50 μl/mL时达到最大；当浓度大于75 μl/mL时，酪氨酸酶蛋白的表达开始降低，当浓度达到500 μl/mL时，酪氨酸酶蛋白的表达明显受抑制。酪氨酸酶活性的增加呈明显的剂量相关性，在浓度为100 μl/mL和150 μl/mL时达到最高，然后又逐渐降低，但均高于对照组。

酪氨酸酶活性的增加与黑素合成的增加不完全一致，可能与复方甘草酸苷中甘氨酸的含量有关。甘氨酸是一种最简单的氨基酸，在蛋白合成中很重要，参与了动物的许多生理反应，国外学者研究发现甘氨酸浓度为1～16 mM时对B16鼠黑素瘤细胞增殖无明显影响，可抑制由α-MSH诱导的B16F0黑素瘤细胞内黑素的合成，且高剂量时可降低酪氨酸酶蛋白的表达，但对酪氨酸酶的活性无影响［8，9］。当复方甘草酸苷浓度为 100 μl/mL时，甘氨酸的浓度为 26.64 mmol/L，当复方甘草酸苷浓度为50 μl/mL时，甘氨酸的浓度在14 mmol/L以内，对细胞的增殖无明显影响，本研究中观察到的复方甘草酸苷浓度在75 μl/mL以上时，酪氨酸蛋白表达降低但酪氨酸酶活性增强可能与甘氨酸浓度增加有关。

黑素分为真黑素和褐黑素两种，是整个黑素形成过程中的两种不同产物，真黑素为棕色或黑色，褐黑素为红色或黄色。研究发现在黑素小体内褐黑素合成过程中巯基的供体来源主要是游离的半胱氨酸，而不是谷胱甘肽［10，11］；培养基中L-酪氨酸和L-半胱氨酸的浓度变化在体外情况下可调节真黑素和褐黑素的比例。在酪氨酸酶的活性足以保证真黑素生成的情况下，控制褐黑素合成的因素是半胱氨酸而不是多巴醌。低浓度的L-半胱氨酸（0.2 mM）增加酪氨酸酶的活性促进黑素的合成，而高浓度的L-半胱氨酸抑制酪氨酸酶的活性，使褐黑素的产生增加［12］。当复方甘草酸苷注射浓度为100 μl/mL，盐酸半胱氨酸的浓度为0.634 mmol/L，本研究中当复方甘草酸苷浓度大于50 μl/mL时，黑素的含量又开始降低，可能与半胱氨酸浓度过高导致褐黑素产生增加有关。

甘草酸苷是由一分子的18β-甘草次酸和两分子的葡萄醛酸构成的亲水性三萜皂苷，是甘草提取物中最重要的有效成分之一，具有抗炎、抗过敏和免疫调节等广泛的药理作用。国内学者粟玉珍等人的研究也发现18β-甘草酸浓度在低于3 mmol/L时对B16鼠黑素瘤细胞无毒性并有促进增殖的作用，但当浓度大于4 mmol/L，B16黑素瘤细胞生长受到抑制。而18β-甘草次酸浓度在大于10 μmol/L时及对B16黑素瘤细胞有抑制作用，且随剂量的增大抑制作用增强［13］。上述研究表明低浓度的甘草次酸对B16鼠黑素瘤细胞有明显的抑制作用，高浓度的甘草酸苷才对B16鼠黑素瘤细胞有抑制作用。B16鼠黑素瘤细胞中酪氨酸酶的活性和黑素的含量与甘草酸苷和甘草次酸浓度呈剂量依赖性增强，甘草酸苷浓度在2 mmol/L时达到最高，甘草次酸浓度在40 μmol/L时达到最高，此浓度对细胞有明显的抑制作用，但在对细胞生长无抑制作用浓度（10 μmol/L以下）时对黑素合成无影响［13］，这与Jung和Abe等的研究结果一致。雷铁池等研究发现甘草等中药的乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶活性有明显的抑制作用，并进一步证实甘草活性成分18α-甘草酸双胺盐在100 μmol/L时，可明显抑制酪氨酸酶的活性和降低黑素的含量而不影响细胞的增殖［14］。这与粟玉珍等的研究结果不一致，他们研究结果的差异可能甘草酸分子结构的差异有关，一个是18β-甘草酸，一个是18α-甘草酸双胺盐；也可能与浓度相关，从雷铁池等研究结果的图表中可以看出当18α-甘草酸双胺盐浓度在1000μmol/ L时也表现为增加酪氨酸酶的活性和促进黑素的合成。当复方甘草酸苷注射浓度为100 μl/mL，甘草酸苷的浓度为4.25 mmol/L。本研究中复方甘草酸苷浓度在100 μl/mL和150 μl/mL时，酪氨酸酶的活性最高，这与粟玉珍等研究结果一致。复方甘草酸苷中的甘草酸苷主要是18β-甘草酸。

因此，复方甘草酸苷可直接激活黑素细胞内酪氨酸酶的活性促进黑素的合成，此外还可以促进黑素细胞内合成的黑素转运到角质形成细胞，这可能是临床上复方甘草酸苷治疗白癜风有效的原因之一。

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（收稿:2016-05-01 修回:2016-06-12）

The effect of compound glycyrrhizin injection on the melanogenesis of B16 murine melanoma cells

YAN Kexiang，ZHU Lvchuan，ZHENG Zhizhong.
Department of Dermatology，Huashan Hospital，Fudan University，Shanghai 200040，China
Correspondence author:ZHENG Zhizhong，E-mail:zhengzhizhong@medmail.com

Objective:To investigate the effect of compound glycyrrhizin injection on melanogenesis and mechanism of B16 murine melanoma cells.Methods:The influence of compound glycyrrhizin injection on the growth of B16 murine melanoma cells and the protein level and enzyme activity of tyrosinase，melanogenesis and melanosome transport was measured by CCK8，flow cytometry，NaOH splitting methods，dopa hydrocarbonylation and western-blotting technique，respectively.Results:（1）There was no influence on the growth of B16 murine melanoma cells when the concentration of compound glycyrrhizin injection was lower than 30 μL/mL；The growth rate of B16 murine melanoma cells was retarded when the concentration was higher than 50 μL/mL；The cells were greatly inhibited when the concentration reached 500 μL/mL.（2）The melanogensis and the protein level of tyrosinase were stimulated when the concentration of compound glycyrrhizin injection was between 10 μL/mL and 200 μL/mL；The melanogenesis was greatly stimulated when the concentration was 50 μL/mL，and the tyrosinase activity was increased in a concentration-dependent manner，which was peaked when the concentration was 100 μL/mL or 150 μL/mL.Conclusion:Compound glycyrrhizin injection can stimulate the melanogenesis and melanosome transport，and increase the tyrosinase activity.

compound glycyrrhizin injection；B16 murine melanoma cell；tyrosinase

复旦大学附属华山医院皮肤科，上海，200040

郑志忠，E-mail:zhengzhizhong@medmail.com