黑素小体在不同肤色皮肤类型角质形成细胞内的分布：黑素小体簇不是具有降解功能的细胞器

黑素小体是人体皮肤黑素细胞、视网膜色素上皮细胞和脉络膜黑素细胞内合成黑素的细胞器。虽然与溶酶体一样都有溶酶体膜蛋白和水解酶，但黑素小体是起源于胞吞途径的一种独立的细胞器类型，且不能通过胞吞示踪剂检测到，另外其pH 值较高，因此被归类为溶酶体相关细胞器。在表皮内，将黑素小体转运至邻近的角质形成细胞至少存在3 种机制：细胞吞噬作用、胞吐/胞吞作用，或经丝状伪足转移。转移后的黑素小体会分布于角质形成细胞的细胞核周围，形成所谓的黑素小体微伞结构，保护DNA 免受紫外线损伤。皮肤内黑素小体分布具有种族差异，也决定着个体的肤色。例如，黑素小体在深色皮肤中彼此孤立，而在浅色皮肤中聚集成簇，形成所谓的黑素小体复合物或包裹体。有意思的是，这种分布被认为是受角质形成细胞起源决定的。有文献报道，将浅肤色的角质形成细胞与深肤色的黑素细胞共培养时，黑素小体在转移之后会发生簇集形成黑素小体簇。相反，将深肤色的角质形成细胞与浅肤色的黑素细胞共培养时，黑素小体则呈弥散孤立状分布。

本研究旨在定性和定量分析不同肤色类型中黑素小体的特征。研究结果发现，存在于中度或轻度色素沉着皮肤内的黑素小体簇是由单层外膜包裹的黑素核构成，表现出溶酶体相关细胞器特征，但不是自噬体或溶酶体。表明它们不是具有降解功能的细胞器，而是作为黑素小体的储存库和一种光防护结构。

一、材料和方法（详细内容参见原文）

二、结果和讨论

1.黑素小体在不同肤色人群皮肤内的分布不同：该研究分析了能够代表肤色多样性（由最浅到最深）的13 个人的皮肤样本。使用光谱色度计根据ITA（individual typological angle）分类评估各样本的肤色类型，并分为3组：轻度色素沉着皮肤组（包括极浅色和浅色皮肤，n=4）、中度色素沉着皮肤组（包括中间色、黄褐色和棕色皮肤，n=6）和重度色素沉着皮肤组（深色皮肤，n=3）。使用低倍率透射电镜观察，发现整个表皮内黑素小体分布随色素沉着水平不同而异。就重度色素沉着皮肤来说，其整个表皮内黑素小体的数量最多，是轻度色素沉着的5倍；基底层角质形成细胞内含有的黑素小体亦最多（约60%），尤其是在细胞核上方；棘细胞层、颗粒层和角质层的角质形成细胞内也能检测到很多黑素小体。在中度色素沉着皮肤中，60%的黑素小体存在于基底层角质形成细胞内，但不如重度色素沉着皮肤内含量丰富；棘细胞层、颗粒层和角质层内仍然可观察到黑素小体。在轻度色素沉着皮肤中，黑素小体大多位于基底层内（超过80%），而在棘细胞层和角质层内几乎观察不到。在极浅色皮肤内，只有基底层的角质形成细胞内有少量黑素小体。这些发现与之前研究结果（针对基底层）一致，并进一步对基底层到角质层的情况进行了定性和定量描述。

对于簇集和孤立的黑素小体，其数量、分布和大小会随皮肤色素沉着类型的不同而异。在轻度色素沉着皮肤中，簇集状和孤立状黑素小体的比例几乎相等，分别为55%和45%。中度色素沉着皮肤中也能观察到黑素小体的不均匀分布模式，其角质形成细胞内含有大量黑素小体簇；簇集状黑素小体的平均含量为70%，孤立状则占30%。

总之，中度和轻度色素沉着皮肤中，簇集状黑素小体与孤立状黑素小体的比例随着ITA 的增加而降低：黄褐色皮肤（ITA：24°）占80%，极浅色皮肤（ITA：66°）占44%。该结果表明，中度色素沉着皮肤中同时存在簇集状和孤立状黑素小体并非亚洲人皮肤所特有，而是与皮肤色素沉着程度有关。

在重度色素沉着皮肤中，基底层角质形成细胞内主要为孤立状的黑素小体（93%），只有少量表现出簇集状（7%），且都均匀分布在角质形成细胞内。

与重度色素沉着皮肤相比，中度和轻度色素沉着皮肤中的孤立状黑素小体明显较小，这与之前结果一致。轻度色素沉着皮肤中小的、簇集状黑素小体与重度色素沉着皮肤中大的、孤立状黑素小体的总体大小相当。因此可得出结论：表皮基底层黑素核能够以某种既定的尺寸存在以达到最佳光防护效果，这对于生发层细胞来说特别重要。同样，相比轻度色素沉着皮肤中少量簇集状的黑素小体，在中度色素沉着皮肤中观察到的大量簇集状黑素小体，可能与较高紫外线照射环境中人对自然的适应有关，因为在这些环境中皮肤需要更强的光防护。无论何种皮肤类型，失去黑素小体膜的裸露的黑素小体（即黑素核）都会被单层外膜包裹成孤立状或簇集状。整体比对方法显示簇集状黑素核包埋在一种高电子密度但不均匀的颗粒状基质中。这种单层膜界定的黑素核不可能直接来源于转移的黑素小体或黑素细胞的胞膜，因为在细胞间隙中发现了没有膜结构的黑素核。

2.孤立状和簇集状黑素核的三维结构：使用电子断层扫描在亚细胞水平上确定组织中孤立状和簇集状黑素核的结构。三维重建图像显示，簇集状黑素核常表现为不规则形状，整个膜也会遵循黑素核在网络中的形状和位置。

簇集状的黑素核轮廓清晰但边界模糊，因此很难区分单一的黑素核。这表明，簇集状的黑素核内包含的黑素沉积并不像在孤立状黑素小体内一样被紧紧地包裹。尤其是在轻度和中度色素沉着皮肤中，较低密度的边界提示，色素可能会从黑素小体纤维状基质中分离，后者通常由PMEL蛋白产生的生理性淀粉样蛋白组成。由于颗粒状基质的性质仍未阐明，因此研究者认为它可能起源于这种黑素的分离。相反，在孤立状黑素小体内，黑素形成了由膜界定的致密核。

X 线断层扫描同样显示，黑素小体与粗面和滑面内质网紧密接触，与线粒体一起位于细胞核周围区域。可以观察到重度色素沉着皮肤中与孤立状黑素小体接触的管状结构，或中度和轻度色素沉着皮肤中与簇集状黑素小体接触的管状结构。这些短管含有颗粒状物质，可能对应已报道的与黑素小体紧密接触的核内体小管，在黑素小体的生物合成和维持中具有关键作用。不能排除这些小管可能有助于降解包埋有黑素的结构蛋白。然而，当它们从黑素小体中出现时，也可以认为这些小管是通过重塑膜结构及其内容物来参与黑素小体运动的。表明黑素小体一旦转移至角质形成细胞，存在生物合成和内稳态机制继续维持黑素小体的功能。黑素小体周围富含细胞器的环境表明，如同在黑素细胞内一样，在角质形成细胞内黑素小体与细胞器存在交互接触。这种接触可能具有不同的功能，如脂质或钙的内平衡，这对于黑素小体的完整性可能是必需的。

3.簇集状黑素核不是自噬体也不是酸性细胞器：白种人和亚洲人皮肤中的黑素小体簇已有描述，但是其结构特征和性质仍未被阐明，它们被认为是具有降解功能的溶酶体结构。因为自噬在白种人皮肤内极为活跃，且黑素小体能够被角质形成细胞吞噬，所以一种合理的假设是，这种簇状结构相当于黑素吞噬体，可能是黑素小体降解的场所。该研究对3种不同类型皮肤的超薄冰冻切片进行免疫金标记，以确定黑素小体/溶酶体膜蛋白（LAMP1、CD63）、溶酶体水解酶（组织蛋白酶Ⅴ）和自噬相关蛋白（LC3A）在整个表皮的分布。使用弱碱3-（2，4-二硝基苯氨基）-3′-氨基-N-甲基二丙胺（DAMP）研究黑素小体簇的酸度。在高度、中度和轻度色素沉着表皮中，在孤立状和簇集状黑素核的膜结构上检测到LAMP1 和CD63。与黑素细胞相比，角质形成细胞内出现的黑素小体（孤立状或簇集状）的LAMP1 标记略高。LAMP1的标记数量较大可能与黑素小体从黑素细胞向角质形成细胞转移的模式有关。尤其是，如果黑素核被胞吐出来然后被角质形成细胞吞噬，那么LAMP1就可能与溶酶体融合的吞噬体膜有关，但这并不意味着簇状结构具有可降解的特性。同样，在簇状结构中不存在LC3A（自噬标记物）和组织蛋白酶Ⅴ（L2），尽管它们被发现都位于表皮上层，与自噬在表皮分化晚期的构成作用一致。组织蛋白酶D 也有类似的结果。有文献报道，在轻度色素沉着皮肤中组织蛋白酶Ⅴ/L2的标记增加，但是没有对其分布进行详细描述。因此，这些结果表明，簇集的黑素核和孤立状黑素小体并不对应着自噬溶酶体/黑素吞噬体。在角质形成细胞内的孤立状黑素小体和簇状结构中检测到CD63的标记，其密度低于黑素细胞内黑素小体上的标记量。然而，鉴于超薄冰冻切片中的标记效率，这个发现是有意义的。此外，它引出了一种假设，即转移至角质形成细胞的黑素小体保持了溶酶体相关细胞器的特征，因为这种四次跨膜蛋白与溶酶体相关细胞器有关，而其本身并不是溶酶体标记物。用一种抗2，4-二硝基苯酚抗体可以检测到弱碱性DAMP蓄积在内体/溶酶体结构中，但是在转移的黑素小体和簇状结构中几乎检测不到，该结果进一步验证了黑素小体簇具有非自噬体、非降解功能的特性。数据表明，根据皮肤黑素细胞内黑素小体的定义（溶酶体膜蛋白，CD63，pH值高于溶酶体），黑素小体簇表现出同样特性，但是它们不含溶酶体水解酶。因为黑素小体簇并不具有自噬结构，不含LC3，并且不是酸性的，该研究提示它们可能相当于保存在基底层内的黑素储存库。

黑素小体簇是如何形成的？通过细胞模型和体内研究发现，转移的黑素小体并不携带黑素细胞内黑素小体膜上出现的蛋白质（如TYRP⁃1）。这些结果提示了一种通过黑素核的胞吐和胞吞作用的黑素小体转移模式，一旦摄取，随后便形成簇状结构。在该研究中，人的皮肤样本无论其色素水平如何，常常可以在黑素细胞与角质形成细胞之间的细胞外间隙内观察到单个黑素核。然而，不同的转移模式是可能共存的，可能取决于所使用的模型系统和皮肤区域。

上述结果可总结为以下两种模型：①黑素小体在不同肤色类型皮肤中的分布，②黑素核在角质形成细胞中的转移和结构。根据这些发现，可以提出关于黑素小体簇的作用和形成的问题和假设。

根据皮肤类型，黑素小体的分解被视为一个渐进过程。在体外，与深肤色皮肤相比，浅色皮肤源性角质形成细胞表现为黑素小体的损耗加速。该研究显示，黑素小体簇不是可降解的或自噬性的细胞器。因为它们似乎并不对应可降解的酸性结构，而可能是在紫外线应激下快速被动员的光防护性或储存性结构。与黑素小体簇密切接触的线粒体和内质网的存在也证实了这一假设。这种接触可能有助于维持簇状结构的内稳态，其方式与之前描述的黑素细胞内孤立状黑素小体相似。基底层内簇状结构的功能值得进一步研究。人们很容易假设，在中度和轻度色素沉着皮肤中，与小的孤立状黑素小体相比，黑素小体聚集在一起使其表面扩大可以增加它们吸收/过滤紫外线的效率。而且，被膜包绕的簇集或孤立状黑素核具有潜在效应分子，能够有助于它们朝向细胞核及其上方运动，以确保其光防护作用。

通过揭示角质形成细胞内黑素小体簇的结构和代谢，该研究结果为以下3 点开辟了新的方向：①了解不同肤色类型中皮肤色素沉着的机制；②揭示自然光防护作用的机制；③制定健康或疾病状态下色素沉着的调节机制。