肺癌合并慢性阻塞性肺疾病患者C反应蛋白与高迁移率蛋白B1的表达水平分析

孙树申　李宝福　王茂军　宋燕峰　郝术安

天津市津南区咸水沽医院内科　天津　300350



肺癌合并慢性阻塞性肺疾病患者C反应蛋白与高迁移率蛋白B1的表达水平分析

孙树申李宝福王茂军宋燕峰郝术安

天津市津南区咸水沽医院内科天津300350

①目的探讨肺癌合并慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者高迁移率族蛋白B1(HMGB1)及C反应蛋白(CRP)水平，分析其临床意义。②方法选择在我院住院的COPD伴肺癌患者作为观察组，同期在我院住院的无COPD肺癌患者作为对照组，同期在我院查体证实无肺功能异常的健康体检者作为正常对照组。采用酶联免疫吸附法检测患者血清HMGB1、CRP的水平，蛋白质印迹法(免疫印迹试验)(Western blot)检测患者HMGB1、CRP的表达，分析其临床意义及影响因素。③结果观察组HMGB1、CRP表达水平较对照组及正常组明显升高，且对照组HMGB1、CRP高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；COPD急性加重期的肺癌患者HMGB1、CRP水平明显高于COPD稳定期的肺癌患者，并且重度COPD、多发肺大泡、呼吸衰竭、III-IV期、有远处转移的患者血清HMGB1、CRP 的水平较轻中度、无肺大泡、 无呼吸衰竭、 I～II期、 无远处转移者高，差异有统计学意义 (P<0.05)；COPD分期、COPD病情严重程度、有无肺大泡、有无呼吸衰竭、肺癌的临床分期、远处转移均是影响实验组患者 HMGB1、CRP 表达的独立危险因素(P<0.05)。④结论HMGB1、CRP在肺癌合并COPD患者中的表达水平升高，COPD分期、病情严重程度、有无肺大泡、有无呼吸衰竭、肺癌的临床分期、远处转移均是影响肺癌合并COPD患者HMGB1、CRP表达水平的独立危险因素。

高迁移率蛋白B1C反应蛋白肺癌慢性阻塞性肺疾病

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD) 以可逆性不完全性气流受限为特征，呈进行性发展，是肺部非特异性炎症性疾病[1]。COPD的病理基础是气道重塑，主要原因是小气道的慢性炎症刺激引起的局部反应，COPD可引起肺血管的异常，早期的肺血管重构是由慢性炎症导致的[2]。高迁移率族蛋白B1 (high mobilitygroup protein B1, HMGB1) 广泛存在于真核细胞核中，是一种非组蛋白，起到调控基因表达的作用。研究发现，其作为细胞因子，广泛参与炎症反应[3]。C反应蛋白(C-reactive protein, CRP) 是一种急性时相反应蛋白，由肝脏产生，在急性炎正反应时极为敏感[4]。本研究选取在我院住院的肺癌合并COPD患者，检测HMGB1及CRP水平，分析其临床意义。

1　资料与方法

1.1一般资料选择于2014年1月～2015年1月在我院住院的COPD伴肺癌患者40例作为观察组，其中男20例，女20例，年龄40～80岁，平均年龄(64.3±6.7)岁。其中COPD急性加重期患者20例，男11例，女9例，平均年龄(65.3±9.1) 岁。COPD稳定期患者20例，其中男14例，女6例，平均年龄(57.4±10.2)岁。选择同期在我院住院的无COPD的肺癌患者40例作为对照组，其中男20例，女20例，年龄38～80岁，平均年龄(62.1±6.4) 岁。选择同期在我院查体证实无肺功能异常的健康体检者20例为正常组，其中男12例，女8例，年龄35～80岁，平均年龄(58.2±9.1) 岁。入组标准：肺癌患者均经病理诊断确诊为肺癌；COPD诊断标准、严重程度分级、稳定期、急性加重期的定义均参考诊疗规范(2011年版)；无精神疾病史，可配合完成本研究。排除标准：支气管哮喘、支气管扩张、活动性肺结核、心肌梗死、创伤、近2周有感染性疾病、伴发恶性肿瘤、伴有免疫性疾病、伴有血液系统疾病、伴有严重的心、肝、肾疾病及糖尿病。各组患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05) ，具有可比性。

1.2实验试剂HMGB1、CRP、酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒：中国南京凯基生物科技发展有限公司；兔抗人HMGB1多克隆抗体、山羊抗人CRP多克隆抗体、山羊抗Action多克隆抗体、Anti-Rabbit lgG/HRP、Anti-Goat IgG/HRP、Western blotting 发光试剂盒、预染的低分子量SDS-PAGE标准蛋白：美国Bio-Rad公司。

1.3实验方法

1.3.1收集外周静脉血标本。所有入组病例抽取前肘静脉血5mL，置于干燥清洁试管中，调整转速3000r/min，离心10分钟，以毛细管吸取上清液，置于-70℃冰箱保存备用。

1.3.2ELISA检测患者血液中血清HMGB1、CRP的水平。准备标准品：在含有不同量的HMGB1、CRP的小瓶中加入蒸馏水0.75mL，轻轻混摇，至少15分钟，并标记浓度以便于计算。准备洗液：浓洗液40mL加入蒸馏水或去离子水960mL。准备孵育液：Tracer 600μL加入抗CRP生物素12mL。洗板：用洗液洗链霉亲合素包被的酶标板1次。加标准品或样本25μL/孔。加孵育液100μL/孔，室温下震荡1小时。用洗液洗6次/孔。加底100μL/孔，室温下震荡30分钟。加终止液100μL/孔，室温下震荡1分钟。酶标仪405nm处测各孔吸光度(OD)值，15分钟内测完。计算:以OD值为纵坐标，HMGB1、CRP浓度为横坐标, 绘制标准曲线。在标准曲线上查得待测标本HMGB1、CRP的水平。

1.3.3Western blot检测患者血液中HMGB1、CRP 的表达。 提取血清总蛋白并检测浓度。取蛋白质40μg/孔进行8%SDS-PAGE，电泳分离蛋白质；室温下封闭1小时。弃封闭液，加入稀释后的一抗，HMGB1为1:200，CRP为1:200，βaction为1:500，孵育半小时，4℃冰箱孵育过夜。弃去一抗，用TBS-T液冲洗，加入二抗稀释液温育，(HMGB1及βaction稀释度为1:2000，CRP为1:2000)，孵育1小时。弃去二抗稀释液，TBS-T清洗后加入显色A、B液各2mL，化学发光显影。扫描显影条带，进行光密度分析。

2　结果

2.1各组血液中HMGB1、CRP的水平采用ELISA检测各组患者血清中HMGB1、CRP含量，结果发现，观察组血清HMGB1为(1.26±0.245)ng/mL、CRP为(24.19±7.76)ng/mL，较对照组及正常组明显升高，且对照组血清HMGB1、CRP的水平高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；结果见表1。

2.2Western blot检测各组患者HMGB1、CRP蛋白的表达采用Western blot法对各组患者血液中HMGB1、CRP的表达进行检测，结果发现，实验组HMGB1、CRP蛋白表达较对照组及正常组明显升高，且对照组HMGB1、CRP的表达高于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2，图1。

表1　ELISA检测各组患者血清中HMGB1、CRP水平

注：与对照组比较，差异有统计学意义，*P<0.05(下同)；与正常组比较，差异有统计学意义，#P<0.05(下同)

表2　Western blot检测各组患者血液中HMGB1、CRP的表达

图1Western blot检测各组患者血液中HMGB1、CRP的表达

2.3实验组不同临床特征患者血清HMGB1、CRP的水平比较对实验组不同临床特征患者血清HMGB1、CRP的水平进行检测，从COPD分期、COPD病情严重程度、肺大泡情况、呼吸衰竭情况、临床分期、远处转移、病理学类型、组织学类型等方面进行比较，结果发现，COPD急性加重期的肺癌患者HMGB1、CRP的水平明显高于COPD稳定期的肺癌患者，并且，重度COPD、有多发肺大泡、有呼吸衰竭、III-IV期、有远处转移的患者血清HMGB1、CRP的水平较轻中度、无肺大泡、无呼吸衰竭、I-II期、无远处转移者高，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3　观察组不同临床特征患者血液中血清HMGB1、CRP水平的比较

表4　观察组患者HMGB1、CRP表达与临床病理特征的多因素分析

2.4观察组患者HMGB1、CRP表达与临床病理特征的多因素分析对单因素分析中的COPD分期、病情严重程度、有无肺大泡、有无呼吸衰竭、肺癌的临床分期、远处转移进行Logistic多因素分析，结果发现，COPD分期、COPD病情严重程度、有无肺大泡、有无呼吸衰竭、肺癌的临床分期、远处转移均是影响实验组患者HMGB1、CRP表达的独立危险因素，其相对危险度,见表4。

3　讨论

气道炎症和气管重构是COPD的主要特点，在COPD的发生、发展中发挥关键作用，持续发展的气道炎症是造成气道重构的主要因素[5]。HMGB1主要由巨噬细胞、单核细胞、垂体细胞等主动释放，由炎症因子刺激引起，普遍存在于高度保守的核蛋白，参与DNA的转录、复制、修复，主要分布于支气管及肺泡上皮细胞，可见于细胞核、胞质及胞膜[6]。HMGB1是新发现的细胞因子，分泌到胞质或胞外，诱导细胞分化，产生趋化作用，其释放较晚，维持时间长，对机体炎症反应的发生、发展、转归等均具有调控作用[7,8]。CRP是一种非糖基化的聚合蛋白，从急性肺炎球菌患者血液中发现，作为一种急性时相反应蛋白，在机体罹患急慢性感染、组织损伤、恶性肿瘤、手术、创伤时水平升高，正常人处于低水平表达[9]。

在本研究中，对三组采用ELISA检测血清HMGB1、CRP的水平，Western blot检测患者HMGB1、CRP蛋白的表达，结果发现，实验组HMGB1、CRP水平较对照组及正常组明显升高，且对照组HMGB1、CRP的水平高于正常组。这表明，肺癌患者血清HMGB1、CRP高于正常，肺癌合并COPD的患者，血清HMGB1、CRP的表达水平明显升高。研究发现，HMGB1作用于单核细胞、内皮细胞主要通过自分泌、旁分泌的形式，表达一系列炎性因子，炎症因子促进HMGB1释放，反复循环，促进炎症反应的发生、发展[10]。COPD急性加重期患者血清中的HMGB1水平比COPD稳定期患者高，重度COPD与多发肺大泡患者比轻中度与无肺大泡患者高，无呼吸衰竭患者的HMGB1明显低于有呼吸衰竭患者，血清HMGB1水平可反映COPD炎性反应与病理改变的严重程度[11]。同本研究结果类似。

本研究对观察组不同临床特征患者血清HMGB1、CRP的水平进行检测，从COPD分期、COPD病情严重程度、有无肺大泡、有无呼吸衰竭、肺癌的临床分期、是否存在远处转移等方面进行比较发现，COPD急性加重期的肺癌患者HMGB1、CRP的水平明显高于COPD稳定期的肺癌患者，对于COPD急性加重期的肺癌患者来说，重度COPD、有多发肺大泡、有呼吸衰竭的III-IV期、有远处转移的患者血清HMGB1、CRP的水平较轻中度、无肺大泡、无呼吸衰竭、I-II期、无远处转移者高；多因素分析发现，COPD分期、COPD病情严重程度、有无肺大泡、有无呼吸衰竭、肺癌的临床分期、远处转移均是影响肺癌合并COPD患者HMGB1、CRP表达水平的独立危险因素。新近研究发现，HMGB1在多种不同类型的肿瘤组织中高度表达，能够评估肿瘤浸润深度、淋巴结转移、肿瘤的大小、转移情况、临床分期是影响恶性肿瘤患者预后的主要因素[12]。研究者用小干扰核糖核酸(RNA)抑制HMGB1基因的表达，结果发现，也达到了抑制肺癌L9981细胞体外增殖和侵袭的目的[13]。还有研究表明，人肺腺癌细胞A549释放HMGB1，采用丙酮酸乙酯能够抑制癌细胞HMGB1的释放，从而抑制了肿瘤的发生、发展[14]。在对非小细胞肺癌患者的研究中发现，患者血清HMGB1放入表达水平比正常对照组增加，并且临床分期越高，HMGB1表达水平越高，且HMGB1的表达水平与肿瘤大小呈正相关[15]。这均与本研究结果相一致。

综上所述，HMGB1、CRP在肺癌合并COPD患者中的表达水平升高，COPD分期、病情严重程度、有无肺大泡、有无呼吸衰竭、肺癌的临床分期、远处转移均是影响肺癌合并COPD患者HMGB1、CRP表达水平的独立危险因素。检测患者血清HMGB1、CRP表达水平可能成为判断疾病发生、发展及预后的新指标，而通过抑制血清HMGB1、CRP的表达，可能成为治疗肺癌合并COPD的新靶点，值得进一步研究。

[1]邱海波. ICU 主治医师手册[J].南京: 江苏科学技术出版社,2012，143

[2]杨晓敏,杨华.慢性阻塞性肺疾病患者肺组织和血清高迁移率族蛋白B1的表达[J].实用医学杂志,2013,29(18):3009-3011

[3]程哲,康燕,吴秋歌，等.HMGB1在支气管哮喘和慢性阻塞性肺疾病患者中的表达及其意义[J].中华医学杂志，2011,91(42):2981-2984

[4]周丽荣,孙宝华.外周血炎症介质水平对COPD疾病状态的预测价值[J].临床肺科杂志,2011,16(23):1877-1878

[5]吕倩,王昌明,蒋明.HIF-1α和VEGF在大鼠COPD中的表达及与肺血管重构的关系研究[J].中国药理学通报,2012,7,28(6):772-777

[6]贺小燕,王海琳,陈晓红，等.HMGB1在卵巢癌中的表达及临床意义[J].现代生物医学进展,2011,11(4):695-697

[7]Wang CM,Jiang M,Wang HJ.Effect of NF-κB inhibitor on high-mobility group protein B1 expression in a COPD rat model[J].Mol Med Rep,2013,7(2):499-502

[8]王震,梅晓冬.高迁移率族蛋白B1与肺疾病的研究进展[J].中国老年学杂志,2011,7(31):2597-2598

[9]邢学勇，李慧.慢性阻塞性肺病不同分期中CRP变化及临床意义[J].临床合理用药,2012,8(5):95-96

[10]张固琴,杨炯,李平,等.血清HMGB1水平评价哮喘严重程度和控制水平的价值[J].临床肺科杂志,2013,18(5):890-892

[11]侯嘉,马伟荣,刘洁.慢性阻塞性肺疾病患者肺组织和血清HMGB1的表达及与TNF-α和IL-1β的相关性[J].中国老年学杂志, 2014,9(34):5064-5066

[12]Gnanasekar M,Thirugnanam S,Ramaswamy K.Short hairpin RNA(shRNA) constructs targeting high mobility group box-1(HMGB1) expression leads to inhibition of prostate cancer cell survival and apoptosis[J].Int J Oncol,2009,34(2):425-431

[13]刘懿,张鹏,吴志浩,等.RNA干扰抑制HMGB1基因表达对肺癌细胞L9981增殖和侵袭的影响[J].中国肺癌杂志,2009,12(6): 549-550

[14]Yan SF,Ramasamy R,Schmidt AM.Receptor for AGE (RAGE) and its ligands-cast into leading roles in diabetes and the inflammatory response[J].J Mol Med,2009,87(3):235-247

[15]Shang GH,Jia CQ,TianH,et al.Serum high mobility group box protein1 as a clinical marker for non-small cell lung cancer[J].Respir Med,2009,103(12):1949-1953

(2015-12-25收稿)(库雪飞编辑)

Expression level analysis of patients with C-reactive protein and high mobility protein B1 united in lung cancer merger with chronic obstructive pulmonary disease

SUNShushen,LIBaofu,WANGMaojun,etal

(Tianjinjinnansalt-watersellhospital,Tianjin300350,China)

ObjectiveTo select the lung cancer hospitalized in our hospital combined chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patients,to detect HMGB1 and CRP levels and to analyze its clinical significance.MethodsSelect hospitalized in our hospital patients with lung cancer combined COPD as experimental group,the without COPD patients with lung cancer hospitalized in our hospital for the same period as the control group,in the same period in our hospital healthy medical examination confirmed that no abnormal lung function as normal group,the patients serum HMGB1 enzyme-linked immunosorbent method,CRP levels,Western blot detection in patients with the expression of HMGB1,CRP protein,to analyze its clinical significance and influence factors.ResultsThe expression level of HMGB1,CRP in experimental group was obviously higher than the control group and normal group,HMGB1,CRP was higher than normal group and control group,the difference was statistically significant(P<0.05)；Acute aggravating period of COPD patients with lung cancer HMGB1,CRP level was significantly higher in lung cancer patients with COPD stabilization,and severe COPD,multiple pulmonary bullae,respiratory failure,III,IV,serum HMGB1 patients with distant metastasis,the level of CRP with mild-to-moderate,pulmonary bullae,respiratory failure,I-II,without distant metastases was high,the difference was statistically significant(P<0.05);COPD in installment,COPD severity conditions,and the presence of pulmonary bullae,presence of respiratory failure,lung cancer,distant metastasis,clinical stage were experimental group patients independent risk factors of HMGB1,CRP expression(P<0.05).ConclusionThe expression levels of HMGB1,CRP is higher in lung cancer patients merger with COPD,COPD in installment,disease severity,the presence of pulmonary bullae,presence of respiratory failure,lung cancer,distant metastasis,clinical stage are affected lung cancer merger HMGB1 COPD patients,CRP expression level of the independent risk factors.

High mobility protein B1. C-reactive protein. Lung cancer.Chronic obstructive pulmonary disease

孙树申(1985-)，男，硕士研究生。研究方向：普内科。

李宝福。

R 734.2

A

2095-2694(2016)04-271-06