NKT细胞激活剂α-Galcer对小鼠肺肿瘤细胞生长的影响

田　雨　王　娜　宋天姣　曹倩文　王　姗　郑全辉

华北理工大学公共卫生学院；①基础医学院河北省慢性病研究重点实验室　河北唐山　063000



NKT细胞激活剂α-Galcer对小鼠肺肿瘤细胞生长的影响

田雨王娜宋天姣曹倩文王姗①郑全辉①

华北理工大学公共卫生学院；①基础医学院河北省慢性病研究重点实验室河北唐山063000

①目的探讨自然杀伤性T细胞(NKT)特异激活剂α-半乳糖苷神经酰胺(α-Galcer)对小鼠肺肿瘤细胞生长的影响。②方法体外培养小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)，经腋部皮下注射雌性C57BL/6小鼠制备肺肿瘤模型。将LLC接种小鼠进一步分为实验组和对照组。实验组小鼠腹腔注射α-Galcer，对照组小鼠注射等量溶剂二甲基亚砜(DMSO)。LLC接种两周后处死小鼠，观察肿瘤生长情况及流式细胞仪检测小鼠外周NKT细胞变化。③结果LLC细胞接种两周后，实验组小鼠肺肿瘤重量明显小于对照组，而实验组小鼠外周NKT细胞数量显著高于对照组。④结论α-Galcer通过促进NKT细胞数量的增加,抑制小鼠肺肿瘤的生长。

NKT细胞α-半乳糖苷神经酰胺肺肿瘤细胞

自然杀伤性T细胞(natural killer T cells,NKT)是一类近年来新发现的T细胞亚群。最初因其细胞表面既表达T细胞受体复合物(TCR-CD3)，同时又表达NK细胞受体如NK1.1而命名，现在认为具有MHC I类样分子NK1.1而命名，具有MHC I类样分子CD1d限制性的T细胞为NKT细胞[1]。与传统T细胞主要识别多肽类抗原不同，NKT细胞通过识别由CD1d提呈的脂类抗原而活化，活化NKT细胞可迅速产生大量Th1和Th2型细胞因子如IFN-γ和IL-4,在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植免疫耐受中发挥作用[2]。α-半乳糖苷神经酰胺(α-Galcer)是从海绵提取物中发现的一类NKT细胞激活剂，能够诱导NKT细胞增殖并产生大量细胞因子，进而激活CD8+T、NK等具有肿瘤杀伤作用的免疫细胞[3]。在此研究中,我们采用小鼠皮下肿瘤模型，观察了α-Galcer对肺肿瘤的抑制效果。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株。小鼠Lewis肺癌细胞系(LLC)由北京北纳创联生物技术研究院提供,在含10%胎牛血清及双抗(青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)的DMEM培养液中培养，条件是饱和湿度、37℃、5%CO，2～3天更换1次培养液。细胞总数达到95%,融合时用0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)消化、传代培养。

1.1.2小鼠。 C57BL/6 小鼠由中国食品药品检定研究院提供[许可证号：SCXK(京)2009-0017],SPF级环境培养。

1.1.3主要试剂及仪器。α-Galcer购于上海西宝生物科技有限公司，二甲基亚碸(DMSO)购于北京康辉试剂有限公司。DMEM细胞培养液、胰蛋白酶消化液、磷酸盐缓冲液(PBS)购自北京今日经典试剂有限公司。荧光素标记抗小鼠B220抗体、抗小鼠TCR-β抗体购自美国BD公司，荧光素标记NKT细胞特异染色试剂CD1d-α-Galcer 四聚体(CD1d-tetramer)购自英国Proimmune公司。流式细胞仪FACS Calibur为美国BD公司产品。

1.2方法

1.2.1皮下肺癌小鼠模型制备。 消化、收集LLC细胞，离心去上清，用无菌生理盐水洗涤两次，将细胞悬浮于生理盐水中，台盼蓝染色细胞活力大于95%。进行细胞计数，调整细胞浓度为1×107/mL。选取6～8周龄雌性C57BL/6小鼠20只，腋下皮肤酒精消毒后注射LLC细胞100μL(1×106)/只。

1.2.2α-Galcer 处理。α-Galcer用DMSO溶解，浓度为100μg/mL。将LLC细胞注射小鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠在LLC细胞接种当天开始腹腔注射α- Galcer,剂量为每只4μg/100μL, 连续注射3次，每次间隔3天。对照组腹腔注射等量DMSO溶液，注射次数及间隔同实验组。LLC细胞接种两周后处死小鼠，观察实验组和对照组小鼠肿瘤生长情况；

1.2.3流式细胞仪分析。LLC细胞接种两周后分别取小鼠脾脏，裂解红细胞，将脾细胞悬于含2%小牛血清的PBS液中，调整细胞浓度为1×107/mL。取以上细胞悬液100μL加入流式管中, 加入2.4G2，4℃封闭10分钟，先加入0.5μL PE 标记的CD1d-α-Galcer 四聚体(CD1d-tetramer)冰上孵育30分钟，再分别加入per-CP标记B220和FITC标记TCR-β抗体，冰上继续孵育30分钟，PBS液洗涤两次后上机检测，数据分析采用Cell Quest分析软件。

2　结果

2.1LLC细胞培养常规培养LLC细胞，当其密度达到细胞瓶95%时传代、扩增，直至细胞数量达到接种要求，见图1。

图1　LLC细胞培养 放大倍数：400×

图2　实验组抑制小鼠肺肿瘤生长

2.2α-Galcer对小鼠LLC细胞肿瘤的影响α-Galcer和对照组小鼠在LLC接种两周后均有明显肿瘤出现。对照组小鼠肿瘤平均重量为(3.27±0.43)克，实验组小鼠肿瘤平均重量为(2.08±0.28)克，实验组小鼠的肿瘤明显小于对照组小鼠，二者比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3α-Galcer对小鼠NKT细胞数量的影响流式检测结果表明，对照组小鼠脾脏NKT细胞所占比率为(0.66±0.06)%，实验组小鼠脾脏NKT细胞所占比率为(1.51±0.09)%，实验组小鼠脾脏NKT细胞比率(P<0.01)和数量(P<0.05)较对照组小鼠均有显著增加，见图3。

注：NKT细胞为TCR-β和CD1d-tetramer染色双阳性细胞

图3实验组增加小鼠外周NKT细胞的比率和数量

3　讨论

肺癌是我国发病率和死亡率最高的肿瘤之一，严重危害人们的身体健康，目前仍无有效的治疗方法。肺癌的发生、发展和转移等与机体的免疫机能密切相关，其中参与固有免疫的细胞如自然杀伤细胞(NK)、树突状细胞(DC)、巨噬细胞以及参与适应性免疫细胞的各类T细胞亚群在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用。NKT细胞是近年来新发现的一个T细胞亚群，产生于胸腺，成熟后主要分布在外周免疫器官和肝脏。活化NKT细胞能够分泌大量不同类型的细胞因子，进而在激活固有免疫和适应性免疫应答过程中发挥重要作用[4]。研究发现，NKT细胞通过激活NK细胞分泌表达IFN-γ和IFN-α，同时可以促进DC的成熟和活化，而成熟的DC又可以进一步活化NK和CD8+T细胞，间接发挥抗肿瘤作用。同时，NKT细胞激活后能够通过穿孔素/颗粒酶、FasL/Fas或者TRAIL直接杀伤肿瘤细胞[5]。

近年来有关NKT细胞在肺癌患者中的变化已有报道，如任林广等[6]研究结果显示肺癌患者组外周血CD3+、CD4+T细胞以及NK、NKT细胞比率均显著低于正常对照组；杨斌等[7]发现肺癌患者中，肿瘤的分期越晚，患者的NKT细胞数量就越少。以上研究结果表明，NKT细胞数量减少或功能降低可能是肺癌发生、发展的一个重要因素。

本研究中我们采用NKT细胞特异激活剂α-Galcer处理肺肿瘤小鼠，由于小鼠NKT细胞在小鼠外周血的比率很低，难于检测，为此，我们主要检测了肺肿瘤小鼠脾脏NKT细胞数量变化。发现α-Galcer处理在增加小鼠NKT细胞的同时，具有显著抑制肿瘤生长的作用，研究结果进一步证实通过提高NKT细胞数量来抑制肺肿瘤发展的可行性，而α-Galcer对肺肿瘤小鼠NKT细胞功能的影响，将在后续实验中加以研究。

[1]Altman JB,Benavides AD,Das R,et al.Antitumor responses of invariant natural killer T cells[J].J Immunol Res,2015,2015(6):1-10

[2]Quanhui Zheng,Li Zhou,Qing sheng Mi.MicroRNA miR-150 is involved in invariant NKT cell development and function[J].J Immunol,2012,188(5):2118-2146

[3]Mcewen smith RM,Salio M,Cerundolo V,et al.The regulatory role of invariant NKT cells in tumor immunity[J].Cancer Immunol Res, 2015,3(5):425-435

[4]李娟，郑全辉.NKT细胞研究进展[J].中国免疫学杂志,2015,31(5):700-703

[5]Huang JR,Tsai YC,Chang YJ,et al.α-Galactosylceramide but not phenyl-glycolipids induced NKT cell anergy and IL-33-mediated myeloid-derived suppressor cell accumulation via upregulation of egr2/3[J].J Immunol,2014,192(4):1972-1981

[6]任林广,张健,徐广伟,等.肺癌患者外周血T细胞亚群与NK、NKT细胞检测的临床意义[J].中国实验诊断学,2013,17(10):1873-1874

[7]杨斌,岳强,王艳峰,等.NKG2D+CD8+NKT细胞及sMICA在肺癌免疫逃逸中的作用[J].中国药物与临床,2011,11(7):796-797

(2016-01-15收稿)(库雪飞编辑)

NKT cell stimulator α-Galcer inhibit the lung tumor growth in mice

TIANYu,WANGNa,SONGTianjiao,etal

(CollegeofPublicHealth,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

ObjectiveTo explore the effect of NKT cell stimulator α-Galcer on the lung tumor growth in mice.MethodsC57BL/6 mice were subcutaneously injected with the Lewis lung tumor cell (LLC).The LLC injected mice were divided into experimental group(injected α-Galcer) and control group(injected DMSO).Two weeks after the LLC injection,tumors from the α-Galcer or DMSO treated group were weighed and the number of NKT cells were detected by flow cytometry.ResultsThe tumors from the experimental group were smaller than that of control group,while the ratio and number of NKT cells from experimental group were higher than that of control group.Conclusionα-Galcer inhibits the growth of lung tumor by increasing the number of NKT cells.

NKT cell.α-Galcer.Lung tumor cell

华北理工大学大学生创新创业训练计划项目(编号：X2015153)；国家自然科学基金项目(编号：81373111)；河北省自然科学基金项目(编号：H2013209019)。

田雨(1994-)，女，在校本科生。研究方向：肿瘤免疫。

郑全辉。

R 734.2

A

2095-2694(2016)04-323-03