复方磺胺甲噁唑片《中国药典》2015版微生物限度检查法的建立

罗　静（重庆市食品药品检验检测研究院重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心401121）

复方磺胺甲噁唑片《中国药典》2015版微生物限度检查法的建立

罗静（重庆市食品药品检验检测研究院重庆市药物过程与质量控制工程技术研究中心401121）

目的建立复方磺胺甲噁唑片的微生物限度检查法。方法2016年3～5月按照《中国药典》2015年版（四部）微生物限度计数方法适用性试验，采用平皿法、薄膜过滤法、薄膜过滤加入中和剂（1.00%对氨基苯甲酸）法对5种阳性菌的回收率进行测定，探索需氧菌、真菌总数的计数方法和控制菌大肠埃希菌检查方法。结果需氧菌、真菌总数验证试验中各菌回收率均达70.00%以上，回收率为0.50%～2.00%时试验组可检出大肠埃希菌，该法符合《中国药典》2015版的要求。结论所建立的方法适用于该品种执行新版药典要求下的微生物限度检查，需氧菌总数和控制菌检查采用薄膜过滤加入中和剂的方法消除复方磺胺甲噁唑片的抑菌作用，真菌总数采用常规法。

复方合剂；磺胺甲基异恶唑/分析；甲氧苄啶/分析；微生物学技术；药物污染；过滤/方法；中和试验

复方磺胺甲噁唑片为磺胺类抗菌药物，是磺胺甲噁唑（SMZ）与甲氧苄啶（TMP）的复方制剂，本品具有较强的抑菌作用，临床主要用于治疗敏感菌，如金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、溶血性链球菌、肺炎链球菌、疟原虫、卡氏肺孢子菌所致的细菌性感染，以及寄生虫感染、细菌性痢疾、流行性脑脊髓膜炎等［1-3］。《中国药典》2015版的微生物限度检查法更靠近欧美药典，与2010年版比较，在试验菌种、培养基、培养条件和检验方法等方面均有较大改变［4-5］。目前，按新版药典进行微生物计数方法验证的研究少见［6-7］。2016年3～5月本研究对复方磺胺甲噁唑片进行了微生物限度检查方法学的验证，现报道如下。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1样品本研究所用样品为重庆科瑞南海制药有限责任公司产品（规格：SMZ0.4g，TMP80mg，批号：160301）。

1.1.2菌株金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、大肠埃希菌［CMCC（B）44102］、白色念珠菌［CMCC （F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］均由中国食品药品检定研究院提供。

1.1.3培养基及试剂胰酪大豆胨（TSA）琼脂培养基（批号：141126）、TSA液体培养基（批号：150916）、沙氏葡萄糖（SDA）琼脂培养基（批号：150824）、麦康凯液体培养基（批号：150924）、麦康凯琼脂培养基（批号：1511103）、氯化钠-蛋白胨缓冲液（pH=7.0，批号：150906）、对氨基苯甲酸（批号：070425）等。

1.1.4仪器QUINTIX612-1CN电子天平购自赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，HVA-110高压灭菌器购自日本HIRAYAMA仪器制造公司，SHH-250LD生化培养箱购自重庆四达实验仪器公司，HF safe-1200生物安全柜购自上海力申科学仪器公司，SW22恒温振荡水浴箱购自德国优莱博公司，HTY-100微生物限度检验仪购自杭州高利医疗器械公司，S60微生物限度培养器购自浙江泰林生物技术有限公司（批号：20160220）。

1.2方法［8-12］

1.2.1需氧菌、真菌总数计数方法适用性试验

1.2.1.1菌液的制备取经35℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌液体培养物分别用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的菌悬液；取经25℃培养18～24 h的白色念珠菌液体培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成适宜浓度的菌悬液；取经25℃培养6 d的黑曲霉斜面培养物，加入含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后吸出悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的孢子悬液。

1.2.1.2需氧菌总数计数（1）试验组。方法一（薄膜过滤法）：称取样品10.0 g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL制成1∶10供试液，加入适宜浓度的菌悬液，使每毫升供试液含菌量小于或等于100 cfu，混匀，取1 mL用薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL冲洗，立即倒入TSA琼脂培养基，待凝固后按规定温度、时间（需氧菌培养温度为35℃，培养3 d；真菌培养温度为25℃，培养5 d）培养，观察结果。方法二（薄膜过滤法）：除用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液600 mL冲洗外其余步骤与方法一相同。方法三（薄膜过滤加入中和剂法）：称取样品10.0 g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL制成1∶10供试液，趁热加入1.00%无菌对氨基苯甲酸溶液5 mL混匀，加入适宜浓度的菌悬液，使每毫升供试液含菌量小于或等于100 cfu，混匀，取1 mL用薄膜过滤，用含0.01%对氨基苯甲酸的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL冲洗，立即倒入含0.01%对氨基苯甲酸的TSA琼脂培养基，待凝固后按规定的温度、时间（需氧菌培养温度为35℃，培养3 d；真菌培养温度为25℃，培养5 d）培养，观察结果。方法四（薄膜过滤加入中和剂法）：除用含0.01%对氨基苯甲酸的pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液600 mL冲洗外其余步骤与方法三相同。（2）菌液组。用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL替代供试液，加入适宜浓度的菌悬液，使每毫升供试液含菌量小于或等于100 cfu，混匀，取1mL加入平皿中，倒入TSA琼脂培养基，待凝固后按规定的温度、时间（需氧菌培养温度为35℃，培养3 d；真菌培养温度为25℃，培养5 d）培养，观察结果。（3）中和剂对照组。用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL替代供试液，趁热加入1.00%对氨基苯甲酸溶液5mL混匀，加入适宜浓度的菌悬液，使每毫升供试液含菌量小于或等于100cfu，混匀，取1mL加入平皿中，倒入含0.01%对氨基苯甲酸的TSA琼脂培养基，待凝固后按规定的温度、时间（需氧菌培养温度为35℃，培养3d；真菌培养温度为25℃，培养5 d）培养，观察结果。（4）供试液对照组。按试验组的供试液制备方法，以稀释液代替菌液，操作与试验组相同，按规定的温度、时间（需氧菌培养温度为35℃，培养3 d；真菌培养温度为25℃，培养5 d）培养，观察结果。另作阴性、空白对照。

1.2.1.3真菌总数计数（1）试验组。方法一（平皿法）：称取样品10.0 g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL制成1∶10供试液，加入适宜浓度的菌悬液，使每毫升供试液含菌量小于或等于100 cfu，混匀，取1 mL加入平皿中，立即倒入SDA琼脂培养基，待凝固后置25℃培养5 d，观察结果。方法二（平皿法）：称取样品2.0 g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL制成1∶50供试液，加入适宜浓度的菌悬液，使每毫升供试液含菌量小于或等于100cfu，混匀，取1mL加入平皿中，立即倒入SDA琼脂培养基，待凝固后置25℃培养5 d，观察结果。（2）菌液组。取pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100 mL替代供试液，加入适宜浓度的菌悬液，使每毫升供试液含菌量小于或等于100 cfu，混匀，取1 mL加入平皿中，倒入SDA琼脂培养基，待凝固后置25℃培养5 d，观察结果。（3）供试液对照组。按试验组的供试液制备方法，以稀释液代替菌液，操作与试验组相同，置25℃培养5 d，观察结果。另作阴性、空白对照。

1.2.1.4回收率计算方法各菌株回收率（%）=（试验组菌落数-供试液对照组菌落数）/菌液组菌落数×100%。根据《中国药典》2015年版（四部）的规定，若回收率为0.50%～2.00%，所用的供试液制备方法及计数方法可用于该样品的需氧菌、真菌总数的计数。

1.2.2控制菌大肠埃希菌检查验证方法

1.2.2.1菌液制备取经35℃培养18～24 h的大肠埃希菌TSA液体培养基培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每毫升含菌量小于或等于100 cfu的菌悬液。

1.2.2.2试验方法（1）试验组。方法一：取1∶10供试液10 mL与每毫升含菌量小于或等于100 cfu大肠埃希菌同时加入100 mL TSA液体培养基中，按《中国药典》2015年版（四部）通则1106检查大肠埃希菌。方法二：取1∶10供试液10 mL薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300ml冲洗，在最后一次冲洗液中加入1.00%对氨基苯甲酸5 mL和每毫升含菌量小于或等于100 cfu大肠埃希菌，置于含0.01%对氨基苯甲酸的100 mL TSA液体培养基中，按《中国药典》2015年版（四部）通则1106检查大肠埃希菌。（2）样品组。取1∶10供试液10mL，以稀释液代替菌液，操作与试验组相同，按《中国药典》2015年版（四部）通则1106检查大肠埃希菌。（3）阳性对照组。将1mL含菌量小于或等于100cfu大肠埃希菌置于100mL TSA液体培养基中，按《中国药典》2015年版（四部）通则1106检查大肠埃希菌。（4）阴性对照组。取稀释液10 mL加入100 mLTSA液体培养基中，按《中国药典》2015年版（四部）通则1106检查大肠埃希菌。

2　结　果

2.1需氧菌总数计数方法适用性试验3次平行试验结果阴性、空白对照均无菌生长。3次回收率试验结果见表1～3。中和剂对照组金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉回收率分别为92.00%、95.00%、94.00%、96.00%、95.00%，均大于50.00%，符合药典对中和剂的相关要求。

表1　第1次回收率试验结果（%）

表2　第2次回收率试验结果（%）

表3　第3次回收率试验结果（%）

2.2真菌总数计数方法适用性试验3次平行试验结果阴性、空白对照均无菌生长。黑曲霉、白色念珠菌的回收率均可达50.00%以上，见表4～6。

表4　第1次回收率试验结果（%）

表5　第2次回收率试验结果（%）

表6　第3次回收率试验结果（%）

2.3控制菌大肠埃希菌检查3次平行试验结果样品对大肠埃希菌有较强抑菌作用，方法二可较好地去除抑菌性，见表7～9。

表7　第1次大肠埃希菌检查方法适用性试验结果

表8　第2次大肠埃希菌验证试验结果

表9　第3次大肠埃希菌验证试验结果

3　讨　论

《中国药典》2015年版整合了2010年版药典一、二、三部有关微生物内容部分，检验方法与国际全面接轨，涵盖标准和方法的整体变化，涉及品种微生物限度检查法需要进行重新验证。涉及附录1105微生物计数法主要修订了如下7个方面：（1）目标检测菌的修订，①细菌总数改为需氧菌总数（包括细菌、真菌总数）；②真菌总数（细菌数）。（2）培养基检测系统、稀释液的修订。（3）基于培养基性能，对细菌计数定义、灵敏度检查的修订。（4）检验方法的修订。（5）删除方法验证试验，增订计数方法适用性试验。（6）微生物计数结果判断的修订。（7）体例的变化，按试验顺序。修订后的计数方法将与美国药典/欧洲药典/日本药典协调后的方法一致，结果将更接近供试品微生物污染情况。

复方磺胺甲噁唑片为磺胺类抗菌药物，具有较强的抑菌活性，因此，本研究在需氧菌总数计数方法适用性试验方面采用薄膜过滤法，加大冲洗量仍然不能去除薄膜上复方磺胺甲噁唑的抑菌活性，于是查阅文献［13-14］得知，磺胺类药物是有抗菌作用的对氨基苯磺酰胺药物的总称，其抗菌作用主要是妨碍细菌体内的正常代谢，因为细菌体内的正常代谢必须有对氨基苯甲酸参与，而磺胺类药物在化学结构上与前者十分类似，很可能被细菌误认为是对氨基苯甲酸而吸收，以致细菌生长和繁殖受到抑制。为更好地去除复方磺胺甲噁唑片的抑菌性，本研究结合对氨基苯甲酸这种中和剂的竞争性抑制作用，获得满意的试验结果。

试验中中和剂的加入量应适量，过多会影响培养基的凝固，过少则不能较好地去除供试品的抑菌性，且2015版《中国药典》要求在制备好的供试液中加入试验菌液再进行薄膜过滤，因此，本研究在供试液、冲洗液及培养基中均加入了中和剂，本研究采用1∶10供试液100 mL中趁热加入1.00%对氨基苯甲酸溶液5 mL，另外在冲洗液和TSA琼脂培养基中均加入0.01%对氨基苯甲酸作为中和剂，可较好地去除抑菌性。

依据本研究结果，可确定其真菌总数采用常规法，需氧菌总数及控制菌大肠埃希菌检查采用薄膜过滤加入中和剂方法。本研究所建立的验证方法符合新版药典的相关规定，可用于该品种微生物限度检查。

［1］ 凌真，丁莉，李倚云，等.复方磺胺甲噁唑片微生物限度检查方法验证［J］.海峡药学，2010，22（1）：51-53.

［2］吕小虎，马泽宁，程建国，等.复方磺胺喹噁啉溶液微生物限度检查方法学验证［J］.中国兽药杂志，2010，44（9）：32-34.

［3］董艳虹，吴阮琦，秦少容，等.复方磺胺甲噁唑片均匀性的相关因素分析［J］.药物分析杂志，2015，35（2）：364-369.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版：四部［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：140-151.

［5］国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版：二部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：107-116.

［6］陈志禹，夏佳，席时东.八珍颗粒《中国药典》2015年版微生物限度检查法的建立及检验结果分析［J］.中国卫生检验杂志，2015，25（23）：4051-4055.

［7］李趣嫦，江艳芳.《中国药典》2010版与2015版微生物限度检查法对四种药物检测结果的比较［J］.中国药品标准，2015，16（2）：86-90.

［8］陈志禹，夏佳，席时东.八珍丸的中国药典2015年版微生物学检查结果分析与评价［J］.药物分析杂志，2016，36（3）：418-425.

［9］曾婧娉，崔蓉，李全兴，等.苯酚滴耳液微生物限度检查方法的建立与验证［J］.中国现代应用药学，2015，32（1）：78-81.

［10］田洪根，陈芳.西他沙星细粒微生物限度检查方法的研究［J］.中国抗生素杂志，2015，40（6）：429-432.

［11］董芳，王嘉南，于风平，等.盐酸莫西沙星片微生物限度检查方法的验证［J］.食品与药品，2015，17（1）：40-43.

［12］万进，林蒙，谢委，等.盐酸左氧氟沙星凝胶微生物限度检查方法验证［J］.医药导报，2015，34（11）：1486-1489.

［13］王伟东，宋强.复方炉甘石外用散无菌检查法的研究［J］.时珍国医国药，2011，22（2）：523-524.

［14］杨龙，晏菊芳，范莉，等.含有对氨基苯甲酸和苯磺酰胺结构单元的新型分子及其抗糖尿病活性［J］.有机化学，2012，32（10）：1908-1918.

Establishment of microbial limit test of Chinese Pharmacopoeia（edition 2015）for compound sulfamethoxazole tablets

Luo Jing（Chongqing Municipal Institute for Food and Drug Control/Chongqing Municipal Engineering Research Center for Pharmaceutical Process and Quality Control，Chongqing 40ll2l，China）

ObjectiveTo establish the microbial limit test of compound sulfamethoxazole tablets.MethodsAccording to the applicability test of microbial limit count method provide by the Chinese Pharmacopoeia（edition 2015，part 4），the plate method，membrane filtration method，membrane filtration adding neutralizing agent method were used to detect the recovery rate of 5 kinds of positive bacteria for exploring the count method of aerobic bacteria and fungi，and the detection method of control bacterium Escherichia coli.ResultsIn the verification test of aerobic bacterial and fungal total count，the recovery rate of each bacterium reached more than 70.00%，when the recovery rate was 0.50%-2.00%，Escherichia coli could be detected.This method conformed to the requirements of the 2015 edition of the Chinese Pharmacopoeia.ConclusionThe established method is suitable for the microbial limit test under the new edition of the Chinese Pharmacopoeia.The membrane filtration adding neutralizing agent method for detecting aerobic bacterial and fungal total count is adopted to eliminate the bacteriostasis effect of compound sulfamethoxazole tablets，the fungal total count usually adopts the conventional method.

Drug combinations；Sulfamethoxazole/analysis；Trimethoprim/analysis；Microbiological techniques；Drug contamination；Filtration/methods；Neutralization tests

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.17.011

A

1009-5519（2016）17-2652-04

罗静（1981-），生药学硕士研究生，主管中药师，主要从事中药材质量标准化研究。

2016-06-01）