银杏叶提取物对去甲肾上腺素诱导的心肌细胞能量代谢障碍与凋亡的影响*

陈　琦，詹亚梅，谢　娟（贵州省人民医院药剂科，贵州贵阳550002）

银杏叶提取物对去甲肾上腺素诱导的心肌细胞能量代谢障碍与凋亡的影响*

陈琦，詹亚梅，谢娟△（贵州省人民医院药剂科，贵州贵阳550002）

目的研究银杏叶提取物（GBE）对去甲肾上腺素（NE）诱导的心肌细胞能量代谢障碍及凋亡的保护作用。方法用1.00 μmol/L NE损伤小鼠心肌细胞（NE模型对照组），用不同浓度GBE（终浓度分别为1.00、0.10、0.01 μmol/L）进行干预，在电子显微镜下观察心肌细胞形态，检测心肌细胞乳酸脱氢酶（LDH）、线粒体琥珀酸脱氢酶（MSDH）及腺苷三磷酸酶（ATPase）活性。结果NE模型对照组大鼠心肌细胞培养上清液中LDH水平升高，MSDH及ATPase活力降低。1.00、0.10 μmol/L GBE能明显升高心肌细胞存活率，降低培养上清液中LDH水平，提高MSDH及ATPase活性，对心肌细胞凋亡具有明显保护作用。结论GBE能有效抑制心肌细胞凋亡，同时，降低LDH水平，增加ATPase及MSDH活性，对NE所致的心肌细胞能量代谢障碍和凋亡具有明显保护作用。

银杏；植物提取物；去甲肾上腺素；肌细胞，心脏；能量代谢；细胞凋亡

心力衰竭是一种复杂的临床综合征，是各种心脏病的严重阶段，其中交感神经活性增加使心肌交感神经末梢分泌去甲肾上腺素（nonepinephrine，NE）增加，是导致心力衰竭的重要因素［1］。且现有研究证实，心肌细胞凋亡在慢性充血性心力衰竭中具有重要作用［2］。银杏作为一种古老的植物，其药用价值高，多年来被广泛应用。银杏叶提取物（ginkgo biloba extract，GBE）是从银杏叶中分离纯化的化合物，近年来，国内外广泛应用GBE治疗神经系统及心血管疾病，有关药理学基础研究也不断获得新的认识［3-5］。

已有研究表明，GBE具有广泛的药理作用，在心血管疾病的治疗方面可增加人血浆抗氧化能力，减少血栓形成，降低血清胆固醇，扩张血管，增加血流量，改善缺血组织代谢，在心肌缺血再灌注中清除氧自由基［6］。GBE中所含的黄酮化合物具有明显的抗氧化和抗自由基活性，其分子中含有还原性羟基功能基团，可直接发挥抗氧化作用。NE对乳鼠心肌细胞的损伤作用与自由基产生较多导致氧化损伤有关，而GBE可通过增强还原性对抗其损伤作用，但其具体作用途径及作用机制尚有待于进一步研究［7-9］。GBE对钙离子（Ca2+）通道具有抑制作用，GBE可能是通过抑制慢钙通道缩短有效不应期而发挥其抗心律失常的作用。为此，观察GBE注射液对NE诱导的小鼠心肌细胞能量代谢及凋亡的影响，可为临床应用GBE的新的适应证的研究提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂小鼠心肌细胞株MCM（上海志研生物有限公司）、GBE（台湾济生化学制药股份有限公司）、葛根素注射液（济南利民制药有限责任公司）、重酒石酸NE注射液［远大医药（中国）有限公司］、高糖杜氏改良Eagle培养基（Dulbecco′smodified Eagle medium，DMEM，Hyclone公司）、胎牛血清（GIBOC公司）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS，Solarbio公司）、0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司）、青霉素-链霉素双抗（Hyclone公司）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，Solarbio公司）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）、ATPase测试盒（高速，南京建成生物工程研究所）、琥珀酸脱氢酶（succinate dehy drogenase，MSDH）试剂盒（南京建成生物工程研究所）等。

1.1.2主要仪器721型可见光分光光度计，Thermo二氧化碳培养箱，EI-808IU型酶联免疫检测仪，Eppendorf 5417R冷冻离心机，XD-101型电生理倒置显微镜，6、24、96孔培养板等。

1.2方法

1.2.1心肌细胞培养培养第3代小鼠心肌细胞，培养基为高糖DMEM，10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素双抗，静置于37℃、5%二氧化碳、饱和湿度条件下培养箱中培养，待心肌细胞生长至80%～90%时用0.25%胰蛋白酶消化，离心后弃上清液，重悬心肌细胞，进行传代，取增殖旺盛、生长状态良好的心肌细胞用于研究。

1.2.2分组取对数生长期心肌细胞进行研究，弃培养液，用PBS洗2遍，0.25%胰蛋白酶消化，离心去除消化液，用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬心肌细胞，调整心肌细胞为每毫升（1～2）×104个。将心肌细胞悬液按每孔100 μL接种于无菌96孔板中，待心肌细胞贴壁后（同步4 h后）去除培养液，用37℃预热PBS洗涤1次，加入用培养液稀释的不同浓度的药物，分为正常对照组，NE模型对照组，GBE高、中、低浓度组（终浓度分别为1.00、0.10、0.01 μmol/L），葛根素组（1 mg/mL）。各组加入药物温孵0.5 h后除正常对照组外，其余各组均加入NE使其终浓度为1.00 μmol/L，继续培养16 h后观察各项指标。

1.2.3观察指标

1.2.3.1观察心肌细胞形态在光学显微镜下观察各组大鼠心肌细胞形态。

1.2.3.2检测心肌细胞MSDH活性（心肌细胞存活率）心肌细胞经NE诱导及给药后每孔加入噻唑蓝（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）溶液（5 mg/mL）20 μL，37℃继续培养4 h。终止培养后每孔加入DMSO150μL，低速振荡5min，然后用酶联免疫检测仪于570nm波长处测定吸光度（A570）。

1.2.3.3检测心肌细胞培养上清液中LDH水平心肌细胞经NE诱导及给药后收集上清液，参照试剂盒说明书测定培养上清液中LDH水平。

1.2.3.4检测心肌细胞腺苷三磷酸酶（adenosine three phosphatase，ATPase）活性心肌细胞经NE诱导及给药后收集上清液并加入0.1%聚乙二醇辛基苯基醚裂解心肌细胞，根据试剂盒说明测定钠离子-钾离子-ATPase（Na+-K+-ATPase）和Ca2+-ATPase活性。

1.3统计学处理应用SPSS13.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，方差齐性检验后，若方差齐两两比较采用t检验，若方差不齐采用非参数检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1各组大鼠心肌细胞形态比较正常对照组大鼠心肌细胞培养16 h后在显微镜下可观察到心肌细胞已大部分贴壁生长，贴壁生长后的心肌细胞多呈梭形或不规则星形，胞体清亮，细胞质成分丰富，向外伸出多个长短不同的突起。随着心肌细胞不断长大，心肌细胞伸出伪足相互交织成网。NE模型对照组大鼠心肌细胞损伤严重，葛根素组、GBE高、中浓度组大鼠心肌细胞损伤强度明显低于NE模型对照组，见图1。

图1　各组大鼠心肌细胞形态比较（400×）

2.2GBE对MSDH及ATPase活性、LDH水平的影响

NE模型对照组大鼠心肌细胞MSDH及ATPase活性降低，培养上清液中LDH水平增加；GBE高、中浓度组大鼠心肌细胞ATPase及MSDH活性明显高于NE模型对照组，培养上清液中LDH水平明显低于NE模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1、2。

表1　GBE对NE诱导的心肌细胞能量代谢障碍及凋亡模型心肌细胞存活率的影响

表2　GBE对NE诱导的心肌细胞能量代谢障碍及凋亡模型心肌细胞LDH水平及ATPase活性的影响（±s）

表2　GBE对NE诱导的心肌细胞能量代谢障碍及凋亡模型心肌细胞LDH水平及ATPase活性的影响（±s）

注：与NE模型对照组比较，aP＜0.05。

组别n LDH A570　U/L ATPase［μmol/（mgprot·h）］Na+-K+-ATPase　Ca2+-ATPase GBE高浓度组GBE中浓度组GBE低浓度组葛根素组正常对照组NE模型对照组5.110±2.320a4.160±1.040a2.670±0.670 4.010±2.090a5.060±1.320 2.330±0.500 6 6 6 6 6 6 0.381±0.012 0.370±0.026 0.518±0.008 0.387±0.002 0.401±0.006 0.575±0.060 416.100±8.010a403.400±8.050a543.700±12.640 422.900±19.540a439.100±14.940 639.100±47.120 5.260±1.510a4.140±2.240a2.570±1.260 5.740±2.880a5.140±1.940 2.300±1.490

3　讨　论

儿茶酚胺（以NE为代表）的大量释放引起的心肌肥大与其过度激动心脏肾上腺素能受体造成的心肌相对缺血、缺氧及儿茶酚胺引起的脂质过氧化、氧自由基的产生、能量代谢障碍和钙超载等相关。且近年来有研究表明，NE诱导的心肌肥大与心肌凋亡通路密切相关［10］。

GBE的主要成分为银杏黄酮苷和银杏总内酯。过去几十年，国内外学者对GBE的作用机制进行了大量研究，基础及临床研究均证实，GBE具有广泛的药理作用：银杏黄酮苷主要作用为清除自由基与抗氧化作用，阻止低密度脂蛋白被氧化；而银杏内酯类的主要作用为拮抗血小板活化因子，改善血流动力学与血液流变学，并能抑制自由基的产生，二者具有交叉、协同作用。

LDH、MSDH、ATPase是反映心肌能量代谢的重要指标。线粒体中的MSDH能代谢还原MTT，同时，在细胞色素C的作用下生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜，经异丙醇作用颗粒溶解显色。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数呈正比，因此，可根据A570推测活细胞数目。心肌细胞膜损伤时导致LDH外漏，使心肌细胞外LDH水平增加。ATPase活性是反映多种细胞能量代谢及功能有无损伤的重要指标。Na+-K+-ATPase对维持细胞膜内外离子浓度平衡具有重要作用。Na+-Ca2+交换跨膜转运，Ca2+能量是由胞内Na+电化学梯度作为转运Ca2+的能源。Ca2+-ATPase在Ca2+和镁离子存在情况下亦可将Ca2+转运至线粒体、肌浆网或细胞外。NE作用于心肌细胞使Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPase活性降低，致使Ca2+大量进人心肌细胞内，形成Ca2+超载。Ca2+是一种强解耦联剂，与电子传递系统亲和力较强，使线粒体氧化磷酸化解耦联，从而使心肌细胞内能量代谢产生障碍。

本研究通过体外培养心肌细胞，采用NE诱导心肌细胞能量代谢障碍及凋亡，并加入高、中、低3种浓度GBE，观察心肌细胞形态学改变、LDH水平、MSDH及ATPase活性等探讨GBE对心肌细胞能量代谢及凋亡的影响。结果表明，NE模型对照组大鼠心肌细胞存活率降低，GBE高、中浓度组大鼠心肌细胞存活率升高，表明GBE对心肌细胞凋亡具有保护作用。NE模型对照组大鼠心肌细胞培养上清液中LDH水平高于正常对照组，提示NE损伤了心肌细胞膜，GBE高、中浓度组大鼠心肌细胞培养上清液中LDH水平明显低于NE模型对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。同时，GBE可改善NE作用后ATPase活性的降低，增强离子泵主动转运离子的功能，以保持细胞内外离子浓度差，增加势能贮备，为细胞的其他耗能过程提供能量。高、中浓度GBE既能有效抑制心肌细胞凋亡，又能降低LDH水平，增加心肌细胞内ATPase活性，与NE模型对照组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。证实GBE可明显抑制高交感活性诱导的心肌细胞凋亡，还能干预心肌的能量代谢，对心肌细胞具有良好的保护作用，间接地为临床选择GBE治疗心血管类相关疾病提供了理论依据。

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Effects of ginkgo biloba extract on energy metabolism disorder and apoptosis in noradrenaline induced cardiomyocytes*

ChenQi，ZhanYamei，XieJuan△（DepartmentofPharmacy，GuizhouProvincialPeople′sHospital，Guiyang，Guizhou550002，China）

ObjectiveTo study the protective effect of ginkgo biloba extract（GBE）on the noradrenaline（NE）induced cardiomyocyte energy metabolism disorder.Methods1.00 μmol/L NE was used to injure the cardiomyocyte（modelcontrolgroup）. Then different concentrations of GBE（final concentration of 1.00，0.10，0.01 μmol/L）were used to conduct the intervention.The cardiomyocyte morphology was observed with electronic microscope.The activity of lactic dehydrogenase（LDH），mitochondrial succinate dehydrogenase（MSDH）and ATPase were determined.ResultsThe LDH level in supernatant of cardiomyocyte culture in the model control group was increased，while the activities of MSDH and ATPase were decreased.1.00，0.10 μmol/L GBE could significantly increase the cardiomyocyte survival rate，decreased the LDH level in supernatant，elevated the MSDH and ATPase activities and had obviously protective effect on cardiomyocyts.ConclusionGBE could effectively inhibit the cardiomyocyte apoptosis，meanwhile reduces the LDH level，increases the ATPase and MSDH activities and has obviously protective effect ton NE induced cardiomyocyte energy metabolism disorder.

Ginkgo biloba；Plant extracts；Levonorepinephrine；Myocytes，cardiac；Energy metabolism；Apoptosis

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.17.005

A

1009-5519（2016）17-2634-03

贵州省中医药管理局中医药、民族医药科学技术研究专项（QZYY2012-40）。

陈琦（1982-），硕士研究生，主管药师，主要从事药理学、临床药学研究。

，E-mail：xiejuan945@sohu.com。

2016-05-13）