一株产几丁质脱乙酰酶丝状真菌的发酵条件优化研究

应聪萍,王　瑶,李永成

(海南大学食品学院,海南海口 570228)



一株产几丁质脱乙酰酶丝状真菌的发酵条件优化研究

应聪萍,王瑶,李永成*

(海南大学食品学院,海南海口 570228)

针对已筛选出的一株能生产几丁质脱乙酰酶(CDA)的海洋丝状真菌,考察其最佳发酵培养基和发酵条件。通过单因素与正交实验得出该菌的最佳产酶条件为:初始pH为6.0,发酵温度为30 ℃,发酵时间为108 h,葡萄糖浓度7 g/L,酵母浸膏浓度7 g/L,氯化钙浓度0.75 g/L,几丁质浓度1.25 g/L,NaCl浓度为1.4%。通过酶活的测定,发现该丝状真菌合成的几丁质脱乙酰酶主要是胞外酶。在最佳发酵条件下该丝状真菌的最高CDA胞外酶活为21.37 U/mL。是一株具有开发潜力的几丁质脱乙酰酶生产菌株。

几丁质,壳聚糖,几丁质脱乙酰酶

壳聚糖(chitosan)是一种比较特殊的可食性动物纤维,含有游离氨基碱性阳离子[1],大多通过虾、蟹外壳中的几丁质脱乙酰而制备[2]。壳聚糖在1985年被Rouget发现并提取出来,至今,这类天然高分子由于其优良的性能如抑菌性、保湿性、吸附性等被各行各业广泛关注,在食品、化工、医药、化妆用品等领域有广泛应用[3]。此外,在国家标准GB-2760中,壳聚糖因具有增稠、被膜功能而被作为食品添加剂[4]。在2014年6月,新的壳聚糖的国家标准正式实施。我们可以从GB 29941-2013中看到壳聚糖在我们的日常生活中应用越来越多[5]。

目前制备壳聚糖的方法有两大类。一类是化学法,采用浓碱热解脱去几丁质中的乙酰基,此法是工业上比较完善的方法,但该法会带来严重的环境污染问题[6]。另一类是生物法,这类方法包括几丁质脱乙酰酶法、微生物培养法、发酵工厂废菌体生产法等[7]。通过几丁质脱乙酰酶水解几丁质生产壳聚糖,在实验程度上已有一定成果[8]。尽管该法克服了环境污染问题,但由于脱乙酰酶法活性不高,现阶段还不能进行工业化大规模生产。因此,通过寻觅新菌种或选用基因工程、诱变育种[9-10]等手段获取具有稳定遗传性状的产高活性几丁质脱乙酰酶的工程菌将成为重要研究方向。

目前,以海洋丝状真菌为来源研究几丁质脱乙酰酶的不多[11],而海洋微生物来源的几丁质脱乙酰酶具有独特优势如耐高盐度等[12-13],实验选用海边红树林土壤中筛选出的一株丝状真菌,通过单因素实验和正交实验获得其最佳发酵条件,提升该菌株的产酶能力和酶活,并为今后几丁质脱乙酰酶法制备壳聚糖的进一步研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

菌种:海洋丝状真菌,从海口东寨港红树林的土壤中筛选出来,4 ℃保藏于实验室冰箱中。

斜面培养基:马铃薯300 g,葡萄糖20 g,琼脂15 g,氯霉素0.1 g,最终pH6.0±0.2,定容至1 L,121 ℃高温灭菌 16 min。

种子培养基:酵母浸膏5.0 g,葡萄糖2.5 g,硫酸铵4.0 g,磷酸二氢钾1.5 g,胶体几丁质1.25 g,NaCl 1.0%,初始pH6.0,定容至1 L,121 ℃高温灭菌16 min。

发酵培养基:酵母浸膏5.0 g,葡萄糖2.5 g,硫酸铵4.0 g,磷酸二氢钾1.5 g,胶体几丁质1.25 g,NaCl 1.4%,初始pH6.0,定容至1 L,121 ℃高温灭菌16 min。

实验设备:T6新世纪紫外可见分光光度计、JB-CJ-1FX超净工作台、LRH-250A生化培养箱、TGL-16M离心机、GM-1.0A隔膜真空泵、PHS-3C pH计、HH-4数显恒温水浴锅、HZQ-X300C恒温振荡器、Fuhe 85-1恒温磁力搅拌器。

1.2实验方法

1.2.1菌种的活化将4 ℃保藏的丝状真菌划线接种于PDA斜面培养基中,30 ℃恒温培养5 d,使菌种活化。

1.2.2培养方法

1.2.2.1种子培养方法挑取一块长势良好的菌种斜面(0.5 cm×0.5 cm),接种于种子液培养基中,在30 ℃、180 r/min条件下摇瓶培养60～72 h。

1.2.2.2发酵培养方法以1 mL/50 mL的比例将种子液接种到发酵培养基中,发酵培养基装液量为50 mL/250 mL,在30 ℃、180 r/min条件下培养108 h,进行几丁质脱乙酰酶的酶活测定。

1.2.3培养条件的确定

1.2.3.1发酵培养基成分影响具体实验参数见1.1中发酵培养基的配方,培养方案见1.2.2.2,其他实验条件如下。

碳源种类:发酵培养基的碳源分别为葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖。

碳源浓度:碳源浓度分别定为0,1,2.5,4,6.5,8 g/L。

氮源种类:发酵培养基的氮源分别为牛肉浸膏、酵母浸膏、蛋白胨、氯化铵、硫酸铵。

氮源浓度:氮源浓度分别定为2.5,5,7.5,10,12.5 g/L。

无机盐种类:发酵培养基的无机盐分别为硫酸镁、七水合硫酸亚铁、硫酸铜、氯化钙、七水合硫酸锌、磷酸二氢钾。

无机盐浓度:无机盐浓度分别定为0,0.75,1.5,2.25,3 g/L。

胶体几丁质添加量:胶体几丁质浓度分别定为0,1,1.25,2,3,4 g/L。

渗透压:氯化钠浓度分别定为0.8%,1%,1.2%,1.4%,1.6%进行渗透压的研究。

1.2.3.2发酵条件的影响发酵培养基的配方为葡萄糖浓度7 g/L,酵母浸膏浓度7 g/L,氯化钙浓度0.75 g/L,几丁质浓度1.25 g/L,NaCl 1.4%。,培养方案见1.2.2.2,其他实验条件如下。

pH:初始pH分别定为5.00,5.50,6.00,6.50,7.00。

培养温度:培养温度分别定为24,26,28,30,33,35 ℃。

1.2.4几丁质脱乙酰酶(CDA)酶活测定方法

1.2.4.1CDA酶液的提取将发酵液在4 ℃、3000 r/min条件下离心10 min,上层清液即为胞外酶提取液;将菌丝体低温抽滤,称重,加入预冷0.05 mol/L pH7.0磷酸盐缓冲液和石英砂,在低温环境中碾磨,浆液立即进行4 ℃、3000 r/min、10 min条件的离心,所得上清液即为胞内酶提取液[14]。

1.2.4.2酶活的测定方法测定酶活的原理为:以对硝基乙酰苯胺为底物,CDA可脱除对硝基乙酰苯胺的乙酰基生成对硝基苯胺,对硝基苯胺在400 nm处有最大吸收峰。通过测定产物溶液在400 nm处的吸光值,来反映CDA的酶活值。

具体测定方法为:10 mL具塞试管中加入1 mL 200 mg/L的对硝基乙酰苯胺溶液、3 mL 0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液,50 ℃水浴3 min,加入1 mL酶液,50 ℃水浴15 min,沸水浴终止酶促反应,加水定容至10 mL,若出现浑浊现象,在3000 r/min条件下离心10 min,在400 nm处测定吸光值。空白对照组添加1 mL灭活酶液,其余同上。在该反应条件下每小时产生1 μg对硝基苯胺所需要的酶量定义为1个酶活力单位(U/mL)[14]。

1.2.5培养基组分因素水平的确定选取碳源浓度(A)、氮源浓度(B)、无机盐浓度(C)、几丁质浓度(D)4个因素,每个因素均在合理范围内取3个值进行正交实验研究,具体详见表1。

表1　因素水平表

2　结果与分析

2.1丝状真菌的生长曲线

生长曲线可以反映液体培养基中微生物群体的生长状况[15]。实验表明,该菌株0～12 h为延滞期,12～60 h为对数生长期,60 h以后进入稳定期。一般情况下,种子液处于对数生长期时活力最强,故实验选择培养60 h的种子液进行接种,具体见图1。

表2　胞内酶活和胞外酶活对比表

图1　真菌生长曲线Fig.1　Growth curve of fungus

注:培养条件:酵母浸膏5.0 g/L,硫酸铵4.0 g/L,磷酸二氢钾1.5 g/L,胶体几丁质1.25 g/L,NaCl 1.0%,葡萄糖浓度见表1,初始pH6.0,在30 ℃、180 r/min条件下培养108 h。

2.2胞内酶活和胞外酶活对比

实验发现,菌株的胞内酶活远远小于胞外酶活,即菌株所产几丁质脱乙酰酶主要为胞外酶。因此,后续实验均只进行胞外酶活的测定。

2.3酶合成过程曲线

酶合成随培养时间变化情况如图2所示。发酵液中酶活于108 h达到最大值20.82 U/mL,此时细胞生长处于稳定期。在0～108 h之间酶活逐步增长,108 h之后酶活开始下降。分析酶活值下降的原因,主要是随着细胞衰老,新陈代谢效率降低所致[16]。超过这个时间段不再生产或少量生产该酶,随时间增长,发酵液中酶浓度不断下降,在一定程度上影响酶活的大小[16]。因此,收获酶的最佳时间为108 h。

图2　CDA酶合成过程曲线Fig.2　The synthesis curve of CDA

2.4发酵培养基成分对产酶的影响

2.4.1碳源种类的影响不同菌种所产生的胞外酶不同,故对不同种类碳源的吸收利用亦不相同。实验采用5种碳源进行实验,表3为丝状真菌利用几种常见碳源产CDA酶的情况。在单因素条件下,以葡萄糖作为碳源发酵时酶活最高,为12.42 U/mL,蔗糖和可溶性淀粉次之,乳糖作为碳源时酶活最差。说明葡萄糖是菌株产酶的最合适碳源。

2.4.2碳源浓度的影响葡萄糖浓度为零时,只有胶体几丁质为碳源来源,酶活因细胞饥饿而成倍增加,酶活较高,为13.15 U/mL。根据碳分解代谢物阻遏(carbon catabolite repression,CCR)效应[17],当供应低剂量葡萄糖时,它能阻遏或者关闭用于其它碳源代谢的基因[18],酶活一定程度下降。在葡萄糖浓度为6.5 g/L时,细胞生长与葡萄糖效应达到一个最佳平衡,酶活达到最高,为14.61 U/mL,超过6.5 g/L浓度后酶活呈下降趋势。因此,葡萄糖在低浓度下影响细胞生长,在高浓度下,则存在葡萄糖效应达,二者均影响CDA的合成。实验表明,葡萄糖最佳浓度为6.5 g/L,其CDA活性最高。

表3　不同碳源对胞外酶活和细胞湿重的影响

图3　葡萄糖浓度对胞外酶活的影响Fig.3　Effect of glucose concentration on extracellular enzyme activity

2.4.3氮源种类的影响实验表明,相同培养条件下,由于有机氮源营养丰富,直接含有少量的游离氨基酸和生长因子[10],有利于菌体的生长,酶活明显优于无机氮源。由表4可以看出,酵母浸膏作为氮源时酶活最高,为17.72 U/mL,牛肉膏次之,无机氮源不利于菌体产酶。因此,最适合菌株发酵产酶的氮源是酵母浸膏。

2.4.4氮源浓度的影响图4表明,随着酵母浸膏浓度的增加,酶活呈现增长趋势,当浓度达到10 g/L,酶活趋于平稳。随着酵母浸膏浓度增加,酶活趋于饱和。故酵母浸膏浓度为10 g/L时最佳。

图4　酵母浸膏浓度对胞外酶活的影响Fig.4　Effect of yeast extract concentrationon on extracellular enzyme activity

2.4.5无机盐种类的影响无机盐的除了提供除碳、氮以外的各类重要元素外,对微生物菌体的生长、酶的生成、酶活性的激活等有重要影响。实验表明,在相同培养条件下,钙离子对酶活的影响程度最高,酶活为14.61 U/mL。详见表5。

表4　不同氮源对胞外酶活和细胞湿重的影响

表5　不同无机盐对胞外酶活和细胞湿重的影响

2.4.6无机盐浓度的影响图5表明,随着氯化钙浓度的增加,该丝状真菌的酶活开始增加较为迅速,到浓度为0.75 g/L以后,酶活出现缓慢下降,酶活最高可达14.61 U/mL,故氯化钙浓度为0.75 g/L时最佳。

图5　氯化钙浓度对胞外酶活的影响Fig.5　Effect of CaCl2 concentration on extracellular enzyme activity

2.4.7几丁质浓度的影响几丁质脱乙酰酶是诱导酶[1],因此几丁质作为几丁质脱乙酰酶的作用底物,在培养基中添加一定量的胶体几丁质将有利于几丁质脱乙酰酶的合成。图6表明,随着几丁质浓度的增加,菌株的酶活开始增加较为迅速,到浓度为1.25 g/L以后,酶活趋于平稳,随后变化幅度不大,趋于饱和,最佳酶活达12.42 U/mL。结果表明,几丁质最佳添加量为1.25 g/L。

图6　几丁质浓度对胞外酶活的影响Fig.6　Effect of chitin concentration on extracellular enzyme activity

2.4.8渗透压的影响渗透压对真菌细胞生命活动的进行有较大的影响。本实验通过NaCl来改变培养基的渗透压。由于该丝状真菌是从海口东寨港红树林的土里筛选出来的海洋微生物,实验表明,制作培养基时选用NaCl浓度为1.4%为佳。详见图7。

图7　不同氯化钠浓度对胞外酶活的影响Fig.7　Effect of NaCl concentration on extracellular enzyme activity

2.5发酵培养基成分正交实验

四因素三水平正交实验的结果如表6所示。

根据极差Rj的大小,可以判断各因素对实验指标的影响力程度。由RD>RC>RB>RA可得出D因素影响力最大,即几丁质浓度这个因素影响最大。其次是氯化钙浓度和酵母浸膏浓度,而葡萄糖浓度的影响较小。

根据极差分析,可得出A3B1C2D2为本实验的最优水平组合,即发酵培养基的最佳成分组合为葡萄糖浓度7 g/L,酵母浸膏浓度7 g/L,氯化钙浓度0.75 g/L,几丁质浓度1.25 g/L。

2.6培养条件对产酶的影响

2.6.1起始pH的影响培养基的pH大小会影响细胞膜所带的电荷,从而影响细胞对营养物质的吸收,或直接影响酶的活性,进而影响细胞的生长和繁殖,所以在发酵过程中需要维持一定的pH以维持微生物的正常代谢[19]。图8表明,菌株在pH为6.0时,CDA酶活达到最高值16.07 U/mL,pH在5.0～6.0之间时酶活迅速上升,超过6.0之后,酶活开始下降。分析原因,pH大于6.0时不适合CDA酶促反应的发生,酶的稳定性下降[10]。发酵培养时最适pH为6.0。

表6　正交实验结果极差分析

图8　起始pH对胞外酶活的影响Fig.8　Effect of initial pH on extracellular enzyme activity

2.6.2发酵温度的影响培养温度能够显著影响微生物的生长速率和代谢途径,不适宜的培养温度会影响生物体内的活性,从而影响酶的合成[20]。图9表明,在30 ℃时,几丁质脱乙酰酶酶活达到最高,为17.53 U/mL,发酵温度选择30 ℃时最佳。

图9　发酵温度对胞外酶活的影响Fig.9　Effect of fermentation temperature on extracellular enzyme activity

2.7条件优化后的发酵进程

在各项条件进行优化后,选取最佳组合对该丝状真菌进行发酵培养,得到结果如图10,即最高酶活为21.37 U/mL,此时细胞湿重为30.92 g/L。

图10　条件优化后的发酵进程Fig.10　The fermentation processafter optimization of conditions

3　小结与讨论

通过生长曲线的绘制、发酵培养基成分单因素实验、发酵培养基成分正交实验、培养条件单因素实验,考察各因素对几丁质脱乙酰酶活性的影响,最终得出该丝状真菌的最佳发酵条件:NaCl浓度为1.4%、葡萄糖浓度7 g/L、酵母浸膏浓度7 g/L、氯化钙浓度0.75 g/L、几丁质浓度1.25 g/L、发酵培养基初始pH6.00,发酵温度为30 ℃,最佳产酶时间为108 h。在此发酵条件下菌株所产几丁质脱乙酰酶的最高胞外酶活值为21.37 U/mL。

几丁质脱乙酰酶作为一种清洁的转化壳聚糖的工具,具有非常广阔的前景,但目前尚未脱离实验室投入生产。实验对一株能产几丁质脱乙酰酶丝状真菌的发酵条件进行优化研究,得出该菌的最佳培养条件,但是,本课题还存在亟待思考的问题。

其一,天然存在的几丁质并非几丁质脱乙酰酶的良好底物,需要使用浓盐酸将其溶解,才能保证其与酶良好接触进行反应。强酸的应用违背几丁质脱乙酰酶法制备壳聚糖防止污染的理念,如何使天然几丁质更容易与酶结合是一个问题。

其二,与众多参考文献比较,该丝状真菌的产酶能力在筛选出的天然菌株中处于中上水平,与经诱变等处理后的菌株相比还有很大差距,故笔者认为采用基因工程、诱变育种等手段进一步提升该菌种的产酶能力可作为下一步的研究方向。

[1]熊晶.产几丁质酶菌株的筛选与鉴定及几丁质酶酶学性质研究[D].长沙:中南大学,2009.

[2]许庆陵,曾庆祝.虾壳甲壳素及壳聚糖提取工艺的研究[J].中国食品添加剂,2013,06:104-109.

[3]谢宇.壳聚糖及其衍生物制备与应用[M].北京:中国水利水电出版社,2010:1-3.

[4]GB 2760-2011,食品安全国家标准-食品添加剂使用标准[S].

[5]GB 29941-2013,食品安全国家标准-食品添加剂-脱乙酰甲壳素(壳聚糖)[S].

[6]蒋挺大.壳聚糖[M].北京:化学工业出版社,2001:68-79.

[7]蔡俊,杜予民.生物法制备壳聚糖的研究进展[J].现代食品科技,2005,01:163-166.

[8]郝之奎.Chitinolyticbacter meiyuanensis的筛选鉴定及其发酵产几丁质酶研究[D].无锡:江南大学,2011.

[9]李专.酶法降解壳聚糖工艺的研究[D].武汉:华中农业大学,2007.

[10]刘丽.几丁质脱乙酰酶产生菌的诱变筛选及发酵条件优化[D].济南:山东师范大学,2011.

[11]刘丹.产几丁质酶渤海丝状真菌(Alternaria tenuissima)的筛选、鉴定及产酶研究[D].天津:天津师范大学,2012.

[12]付星,闫巧娟,江正强,等.高产几丁质酶巴伦葛兹类芽孢杆菌的筛选和发酵条件优化[J].微生物学通报,2015,04:625-633.

[13]Debashish G,Malay S,Barindra S,et al. Marine enzymes[J].Advances in Biochemical Engineering-Biotechnology,2005,96:189-218.

[14]刘丽萍,刘建军,赵祥颖.一种简易、高效产几丁质脱乙酰酶菌种的筛选方法[J].食品与发酵工业,2008,34(1):65-68.

[15]周德庆.微生物学教程 第3版[M].北京:高等教育出版社,2011:153-156.

[16]谢笔钧.食品化学 第3版[M].北京:科学出版社,2011:319-336.

[17]Gorke B,Stulke J. Carbon catabolite repression in bacteria:many ways to make the most out of nutrients[J]. Nat Rev Microbiol,2008,6(8):613-24.

[18]毕海洋.马克斯克鲁维酵母菌乳糖酶基因的高效表达和高活力乳糖酶的生产[D].青岛:中国海洋大学,2014.

[19]何苑皞.甲壳素脱乙酰酶高产菌株的筛选、发酵及酶学基本性质研究[D].长沙:中南林业科技大学,2009.

[20]Montgomery D C. Design and Analysis of ExPeriment[M]. New York:John Wiley & Sons,Inc.1980,176-177.

Optimization of fermentation conditions of a strain of filamentous fungus producing chitin deacetylase

YING Cong-ping,WANG Yao,LI Yong-cheng*

(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

The optimum media composition and fermentation conditions were studied for chitin deacetylase(CDA)production by a screened marine filamentous fungus. Using single factor method and orthogonal experiment in test,the best culture conditions of enzyme was obtained as followings:cultured for 108 h at pH 6.0,and 30 ℃,,the media consist of glucose 7 g/L,yeast extract 7 g/L,CaCl20.75 g/L,chitin 1.25 g/L and NaCl 1.4%. Moreover,after the determination of enzyme activity,it was found that the marine filamentous fungus mainly produced extracellular enzyme. Under this condition of the fermentation,the highest chitin deacetylase activity reached 21.37 U/mL. In general,it was a chitin deacetylase producing strain that had the potential to carry out research further.

Chitin;chitosan;chitin deacetylase

2015-05-19

李永成(1964-)，男，博士，副教授，研究方向：生物化工，E-mail:lyc2360@sina.com。

应聪萍(1993-)，女，本科，研究方向：食品质量与安全，E-mail:yingcongping2327@163.com。

十二五国家科技支撑计划项(2012BAD2B06)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000