黑木耳栽培过程中抗霉能力及胞外酶活性变化

2017-07-21李红杨镇吕立涛刘岩岩张敏

江苏农业科学 2017年10期

李红+杨镇+吕立涛+刘岩岩+张敏

摘要：以5个黑木耳（Auricularia auricula）栽培菌株（8808、黑29、981、黑威2号、黑威4号）为试验材料，研究黑木耳栽培过程中4种胞外酶活性[羧甲基纤维素酶（CMCase）、滤纸纤维素酶（FPase）、漆酶（LAC）、多酚氧化酶（POD）]的变化及酶活性与产量、抗霉能力之间的相关性。结果表明，菌株产量大小排序为黑威2号>黑威4号>981>8808>黑29，黑威2号显著高于其他菌株，黑威4号和981菌株差异不显著，8808和黑29菌株产量最低；各菌株抗霉能力有明显差别，黑威2号、黑威4号、981菌株抗霉能力较差，8808和黑29菌株抗霉能力较强。不同菌株胞外酶活性不同，但在整个生长发育过程中变化规律基本一致，即随着黑木耳子实体的生长发育，CMCase、FPase、LAC、POD活性逐渐增强，而后维持在相对稳定的水平。8808、黑29菌株CMCase、FPase、POD酶活性相对较低，981、黑威2号、黑威4号菌株酶活性较高。相关性分析表明，不同胞外酶活性之间具有显著或极显著相关性，不同的胞外酶活性又与抗霉能力、产量有一定的相关性，从而为黑木耳抗病育种、黑木耳生产提供了理论依据。

关键词：黑木耳栽培；抗霉能力；胞外酶；酶活性；产量；抗霉能力

中图分类号： S646.601文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2017）10-0109-04

黑木耳（Auricularia auricula）是中国广泛人工栽培的食用菌品种，其栽培业已成为广大菇农走上致富道路的支柱产业之一[1]。黑木耳食味鲜美，含有丰富的营养成分，具有很高的食、药用价值[2-3]。近年来，随着人们生活水平的提高，对木耳的消费需求激增，木耳总产量也随之快速增长。但大量菌种品种退化、老化、不利变异，致使栽培性状难以预测，造成栽培特性、栽培产量的不确定性[1]。有研究报道，侧耳（Pleurotus）、金针菇（Flammulina velutipes）菌丝羧甲基纤维素酶活性与子实体产量成正相关关系，以木屑为主料栽培的黑木耳在子实体形成期间胞外纤维素酶活性逐渐上升[4]。黑木耳的纤维素酶、半纤维素酶活性与栽培基质的降解速率、子实体的产量有关，表明食用菌胞外酶活性变化在栽培过程中存在一定的规律[5-7]。从目前的研究成果来看，相关食用菌胞外酶活性研究报道较多，而如何通过菌种检测，鉴定菌种活性、健康程度，预测栽培特性、栽培产量的研究较少[5-7]。黑木耳菌种培养过程中通过酶活性测定研究菌种生长中的酶活性变化规律，检测菌种分解纤维素、木质素等的能力，可在一定程度上检测菌种老化、退化、不利变异，杜绝劣质菌种危害菇农，为黑木耳栽培生产提供科学、系统的理论依据，因此研究黑木耳胞外酶在栽培过程中的活性变化规律对菌种优劣显得十分重要[5-6，8]。一方面通过各菌株培养时间与酶活性变化关系的研究，探讨菌株菌丝生长過程中酶活变化的规律性；另一方面通过纤维素、木质素分解酶类的测定，可检测菌株分解基质能力强弱变化，检测菌株因在非纤维基质中长期生长、保藏、传代引起酶活性退化问题，检测因大量引种、扩繁引起的菌株老化、退化、不利变异的发生以及病毒感染引起菌株退化问题，防止劣质菌种流入市场[2-3]。有鉴于此，本试验选择栽培性状差异较大的5个黑木耳优良菌株，研究栽培过程中菌株胞外漆酶（LAC）、多酚氧化酶（POD）、羧甲基纤维素酶（CMCase）、滤纸纤维素酶（FPase）的酶活性变化，为我国黑木耳栽培用种活力检测、菌种退化及黑木耳栽培工作提供科学系统的理论参考依据。

1材料与方法

1.1供试菌株

黑木耳1～5号菌株分别为8808、黑29、981、黑威2号、黑威4号，均由辽宁省农业科学院微生物研究所菌种保藏中心提供。

1.2培养基

母种培养基（L）：马铃薯200.0 g煮汁，葡萄糖20.0 g，磷酸二氢钾3.0 g，硫酸镁1.5 g，蛋白胨0.5 g，维生素B1 10.0 mg，琼脂粉14.0 g。

1.3试验方法

原种瓶（500 mL葡萄糖空瓶）装培养料折合干料约140 g（湿质量400 g），栽培袋装培养料折合干料约280 g（湿质量800 g），121 ℃灭菌2 h，取母种培养基活化菌种3块（3.0 mm×3.0 mm）接于原种培养料中，25 ℃培养30 d，菌丝发满后以2%的接种量接入栽培种培养料中，25 ℃培养70 d，每个菌株各接种100袋。分别在菌丝生长10、20、30、40、50、60、70 d 时取样，每个菌株每个时期取样3袋，分别压碎混匀，用于粗酶液制备。

1.5粗酶液制备

250 mL三角瓶中装入打碎混匀样品5.0 g，加蒸馏水 25 mL，25 ℃下150 r/min浸提4 h，4 ℃离心10 min（2 500 r/min），上清为粗酶液，4 ℃冰箱短期保存，酶活性测定设1个空白对照、3个重复。

均匀取培养一定时间的酶样培养基5.0 g，加入蒸馏水25 mL，25 ℃下恒温摇床以150 r/min浸提4 h，5 000 r/min、4 ℃ 离心10 min，取上清液为待测酶样。

观察发霉洞穴数。

1.6酶活测定[7]

1.6.1LAC活性测定

取13.36 mmol/L邻联甲苯胺（用95%乙醇溶解）0.5 mL作为底物，加入0.1 mol/L醋酸缓冲液（pH值为4.6）3.4 mL、0.5 mL酶液，28 ℃下反应30 min，于600 nm处测吸光度。另取同量酶液，沸水浴5 min灭活后作为对照。酶活性单位定义：以1 g培养物与底物作用3 min内改变0.1个吸光度为1个酶活性单位（U）。

1.6.2POD活性测定

取0.1 mol/L邻苯二酚2.0 mL，加入0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH值为6.0）2.0 mL、0.5 mL酶液，28 ℃下反应 30 min，于400 nm处测吸光度。另取等量酶液，沸水浴5 min灭活后作为对照。酶活性单位定义：以1 g培养物与底物作用30 min内改变0.1个吸光度为1个酶活性单位（U）。

16.3CMCase活性测定

在试管中加入0.5%羧甲基纤维素钠溶液1.5 mL，加粗酶液1.0 mL，50 ℃ 水浴保温30 min，取出后立即加入二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）1.5 mL，100 ℃ 水浴5 min，冷却后加入蒸馏水定容至25 mL，混匀，测520 nm处吸光度。另取同量酶液，沸水浴5 min灭活后，作为对照。以不同浓度的葡萄糖溶液与DNS试剂反应，测520 nm处吸光度，制作葡萄糖标准曲线。酶活性单位定义：以1 g培养物中的酶量与底物作用30 min释放出1 mg葡萄糖为1个酶活性单位（U）。

1.6.4FPase活性测定

采用滤纸为底物测定FPase活性，分别于酶解管中加入滤纸，0.05 mol/L柠檬酸缓冲液（pH值为4.5）1 mL，酶液1 mL，50 ℃下保温 30 min，取出后立即加入DNS试剂1.5 mL，100 ℃水浴5 min，冷却后加蒸馏水至 25 mL，混匀，测520 nm处吸光度。另取同量酶液，沸水浴 5 min 灭活后，作为对照。酶活性单位定义：以1 g培养物中的酶量与底物作用30 min释放出1 mg葡萄糖为1个酶活性单位（U）。

2结果与分析

2.1不同菌株的产量分析

由图1可知，各菌株间产量有明显差别，菌株产量大小排序为黑威2号>黑威4号>981>8808>黑29，新复极差法求出各菌株间差异性，黑威2号显著高于其他菌株（P<0.05），黑威4号、981菌株差异并不显著（P>0.05），8808、黑29菌株产量最低。

2.2供试菌株的抗霉性分析

由图2可知，各菌株抗霉能力有明显差别，其中菌株抗霉能力大小排序为黑29>8808>981>黑威4号>黑威2号，黑威2号、黑威4号、981菌株抗霉能力较差，8808、黑29菌株抗霉能力较强。用新复极差法求出各菌株间抗霉能力差异性，黑威2号、黑威4号、981菌株抗霉能力显著低于其他2个菌株（P<0.05）。

2.3供试菌株5种胞外酶活性分析

[CM（26]2.3.1LAC活性变化

5个供试黑木耳菌株在栽培过程中

LAC活性变化如图3所示，由图3可知，LAC活性变化基本趋势一致，981、黑威2号、黑威4号菌株酶活性较高，981、黑威4号酶活性最高峰值出现在培养的60 d。其他菌株酶活性差别不大，酶活性相对较低的菌株有8808、黑29。各菌株酶活性峰值出现的时间不同，5个供试黑木耳菌株酶活性高峰均出现在培养的60 d左右，培养30 d以后，酶活性高峰有所波动。

2.3.2POD活性的变化

在栽培过程中，5个供试菌株的POD活性有升有降，但总体上呈逐渐上升趋势（图4）。图4中，随着培养时间的延长，981、黑威2号、黑威4号菌株酶活性较高，50 d以后981、黑威4号菌株酶活性有所降低，黑威2号酶活性在培养的60 d达到最大。8808、黑29菌株酶活性相对较低，在培养的20 d达到最高峰，之后一直维持在较低的水平。

2.3.3CMCase活性变化

CMCase酶活性随培养时间延长而增加，随后有所降低，降到一定低水平时酶活性又有所升高，呈有交替性的升高下降趋势。图5显示，981、黑威2号、黑威4号菌株酶活性较高，黑威2号、黑威4号酶活性在培养的30 d达到第1个高峰，培养的50 d达到第2个高峰，之后酶活性最高峰交替波动。8808、黑29菌株酶活性相对较低，最高峰出现得比较早，在培养的30 d达到最高峰，之后一直维持在较低的水平，在培養的时间内酶活性变化不大。

2.3.4FPase活性变化

栽培过程中FPase活性变化如图6所示，随着栽培时间的延长，981、黑威2号、黑威4号FPase活性迅速升高，而后其峰值交替出现。8808、黑29菌株酶活性相对较低，变化幅度也相对较小，20 d以后趋于稳定的变化趋势，在前60 d表现为黑29>8808，60 d以后表现为黑 29>8808。

2.4不同菌株胞外酶相关性分析

相关性分析结果显示（表1），供试菌株间产量与 CMCase、FPase、LAC活性呈显著正相关（P<0.05），与抗霉性呈显著负相关（P<0.05）；抗霉性与CMCase活性呈极显著负相关（P<0.01），与FPase、LAC、POD活性呈显著负相关（P<0.05）；LAC活性与 CMCase、FPase、POD活性呈极显著正相关（P<0.01）；POD活性与CMCase、FPase活性呈极显著正相关（P<0.01）；CMCase 活性与FPase活性呈极显著正相关（P<0.01）。

3结论与讨论

在黑木耳栽培过程中研究各菌株胞外酶活性变化规律，了解其在整个发育阶段的分泌特点、活性大小、变化规律，推测其在不同生长发育阶段对培养基中木质纤维素等大分子营养成分的降解动态，对提高培养料利用率有重要意义[5-7]。此外，黑木耳栽培过程中合成的各类酶，可使大分子物质降解生成葡萄糖并被食用菌利用，生成各类有机活性物质。研究各[CM（25]菌株在菌丝生长各阶段（母种、原种、栽培种）的酶活性变

化规律，找出各菌株在培养过程中酶活性的变化特点，建立各菌株酶活性变化规律基本图谱，绘制某些特定菌株的特定酶活性曲线，了解其酶学基础用于菌株的鉴定工作[7]。本试验研究显示，被测各菌株酶活性变化存在一定的规律性，这一变化规律表明菌株正常生长的活力。当测定的酶活性及变化规律发生大改变时，就应该考虑停止使用该菌株，并进行栽培试验测试，以检测该菌株是否发生栽培性状的改变。

木质素分解能力与食用菌代谢过程中合成的木质素分解酶有关，LAC、POD是目前公认的木质素分解酶之一，它能在O2存在的条件下脱去羟基上的电子或质子形成自由基，导致酚型木质素侧链脱羧或脱氢，造成C—C键断裂，从而降解木质素[2-3]。LAC、POD是与木质素等大分子物质降解有关的酚氧化酶，它能加速木质素等芳香族高分子化合物的分解[8-11]。本研究表明，原种培养基中存在丰富的木质素作用底物，黑木耳菌丝生长过程中可向基质中源源不断地分泌LAC、POD等木质素酶，当培养菌丝产生的酶积累到一定水平时，表现为酶活性升高，激发酶与底物结合降解木质素，生成小分子而被菌丝生长利用，酶与底物结合后酶活性下降，菌丝生长。在酶活性监测的过程中，随酶活性的升高而降低，能较清晰地看到酶与底物之间的相互作用，这种作用的高低强弱与菌株自身分解基质能力有关，在检测中如果发现某些菌株的酶活性发生异常，就应停止该菌株的大规模生产使用，并进行栽培试验检测。

黑木耳栽培过程中各菌种以分解基质中的纤维素、半纤维素、木质素来满足其生长繁殖所需要的营养，而这些大分子物质须在纤维素酶的作用下才能够分解，培养基中存在大量的纤维素。CMCase是一种诱导酶，随着菌丝生长发育，菌丝细胞分泌的胞外CMCase逐漸增多，因此CMCase活性随着培养时间逐渐增加。LAC、POD活性是与木质素等大分子物质降解有关的酶，本研究显示，LAC、POD活性随着栽培时间的延长呈上升趋势，与前人的研究结果[5-7，12-14]一致。试验中5个黑木耳菌株的CMCase、FPase、LAC、POD活性在菌丝生长期较低，随着子实体的形成和成熟而逐渐增高，这符合木质素类物质优先利用的推断。5个供试菌株中，黑29产量一般，而本试验测定的4种胞外酶活性中该菌株也相对较低，分析低酶活性可能与该菌株退化有关。

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