苦菜不同部位营养成分及其生理活性测定

霍　莉,锁　然,李　宁,王　颉

(1.河北农业大学园艺学院,河北保定 071001;2. 河北大学化学与环境科学学院,河北保定 071000)



苦菜不同部位营养成分及其生理活性测定

霍莉1,2,锁然1,李宁1,王颉*

(1.河北农业大学园艺学院,河北保定 071001;2. 河北大学化学与环境科学学院,河北保定 071000)

苦菜不同部位(根、花、茎、叶)及苦菜全草用70%的乙醇溶剂超声辅助提取30 min,测定苦菜不同部位酚酸、黄酮、多糖和皂苷等营养成分含量,并用自由基清除法检测各提取物的抗氧化能力及考察提取物对尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响。结果表明:苦菜不同部位有效成分含量差别明显,多糖、皂苷含量为根>叶>花>茎;黄酮、酚酸含量为叶>花>茎>根;苦菜各部位提取液抗氧化性强弱顺序为叶>花>茎>根,可以推断苦菜抗氧化性与黄酮、酚酸含量有关;而对尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰胆碱均有一定抑制作用。

苦菜,营养成分,生理活性

苦菜(IxerisChinensis)能使尼古丁中毒的蛇“起死回生”[1-2],但机理报道很少。苦菜是一种药食两用的菊科苦苣属多年生草本植物,折断有白汁且味苦,广泛生长于全国各地,全草含有多种营养成分[3-4]。其中,苦菜多糖有抗腹泻和防便秘的双向效果[5];小鼠实验性肝损伤经苦菜黄酮作用后有良好的受保护效果[6-9];酚酸类化合物有消炎、抗菌、抗血栓形成等作用[8-9];苦菜皂苷具有清热解毒,消痈排浓,祛瘀止痛作用[7]。苦菜中有多种成分具有抗氧化性,韩阳阳等[10]研究了苦菜不同部位提取物的抗氧化活性,但苦菜不同部位营养成分含量的差异性及与其抗氧化能力的关系鲜见报道。尼古丁中毒的蛇是尼古丁刺激神经系统中烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs),从而产生生物学效应,内源性神经递质是乙酰胆碱(ACH)[11-14]。本实验室首次从小鼠体内探讨了苦菜对尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响[14]。

本文主要利用紫外-可见分光光度法对苦菜不同部位提取液中多糖、黄酮、酚酸、皂苷等营养成分进行测定,并通过考察苦菜不同部位提取液的抗氧化能力以及对尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响,探究苦菜营养成分与其生理活性的关系。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

苦菜(山苦荬,采于河北保定田间,经河北农业大学生命科学学院植物学系冯大领老师鉴定为菊科苦荬菜属植物苦菜Ixerischinxensis),鲜苦菜洗净自然晾干后高速粉碎成粉末;实验动物:雄性昆明种小鼠(18～22 g),32只,购于北京阜康生物科技有限公司。动物许可证号为SCXK(京)2009-0004;冰乙酸,高氯酸、无水碳酸钠,十二烷基磺酸钠,铁氰化钾、三氯化铁、溴甲酚绿,无水氯化铝,苯酚、硫酸铜亚硝酸钠、硼酸,硫酸钾天津市塘沽区新华化工厂;邻苯二甲酸氢钾天津市化学试剂研究所;以上试剂均为分析。纯葡萄糖、芦丁、熊果酸、绿原酸、香草醛,DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)(北京中生瑞泰科技有限公司),以上试剂均为标准品99%;尼古丁,陕西弘康生物科技有限公司提供;乙酰胆碱(ACH)测定试剂盒南京建成生物工程研究所。

可见分光光度计722N上海精密科技仪器有限公司;紫外-可见分光光度计TU-19011,北京普析通用有限责任公司;台式高速离心机德国艾本德股份公司;超声波清洗器(B32005T,40 KHZ,必能信超声有限公司);RE_52A旋转蒸发仪上海亚荣生化仪器厂;Thermo Scientific全波长酶标仪美国Thermo fisher scientific公司。

1.2苦菜不同部位有效成分的提取

分别称取苦菜各部位粉末(根、花、茎、叶)0.5000 g于锥形瓶中,用70%乙醇30 mL于室温下超声(40 kHZ)30 min,离心后取上清液,备用。测定苦菜不同部位皂苷、黄酮、多糖、酚酸含量及其抗氧化活性[15-19]。

干苦菜叶提取物(根、叶):取干苦菜5 g(根或叶),按料液比1∶60(质量比)加入70%乙醇溶液,加热至沸腾2 min,超声30 min,离心后取上清液,50 ℃旋转蒸去乙醇后加水25 mL超声溶解,用于喂食尼古丁急性中毒小鼠,测定其对血清乙酰胆碱含量影响。

1.3各营养成分的测定方法

1.3.1总皂苷含量的测定参考文献[15]准确配制100 μg/mL熊果酸标准溶液。梯度吸取熊果酸标液于试管中,水浴真空抽干溶剂,加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.6 mL和0.8 mL高氯酸,摇匀,60 ℃下水浴加热15 min,取出后立即用冰水冷却10 min,加入5 mL冰乙酸,摇匀后静置20 min,以空白溶液作为对照,在最大吸收波长548 nm下测定其吸光度。

吸取0.1 mL试样于试管中水浴真空抽干溶剂后,作与标准液相同的显色处理,在最大吸收波长548 nm下,以70%乙醇作上述同样处理做空白,测定其吸光度。

1.3.2黄酮含量的测定参考文献[16-17]梯度吸取0.1 mg/mL的芦丁标准溶液分别置于10 mL的试管中,先用30%的乙醇补至5 mL,再分别加入10%硝酸铝0.3 mL,静置5 min,加入5%亚硝酸钠0.3 mL,静置5 min,加入4%氢氧化钠3 mL,最后用30%乙醇定容至10 mL,摇匀,静置15 min,以空白溶液作为对照,在510 nm下测其吸光度。

取1.0 mL苦菜各部位提取液于试管中,与上述的芦丁做相同的显色处理,以70%乙醇作上述同样处理做空白,在510 nm下测定其吸光度。

1.3.3多糖含量的测定参考文献[18]梯度吸取1 mg/mL的葡萄糖标准溶液于25 mL容量瓶,按糖液∶显色液=1∶5比例加入试管,震荡混匀,置于沸水浴中保温30 min,取出冷却至室温,以空白溶液作对照,在490 nm波长下测定吸光度。

取0.1 mL苦菜各部位提取试液于试管中,加5 mL苯酚-浓硫酸显色液,混匀后于沸水中保温30 min后取出冷却至室温,然后以70%乙醇作上述同样处理做空白,在490 nm下测定吸光度。

1.3.4酚酸含量的测定参考文献[16]梯度吸取35.0 μg/mL绿原酸标准溶液分别置于容量瓶(25 mL),加无水乙醇(5.0 mL),摇匀后加入0.3% 十二烷基磺酸钠溶液(2.0 mL)、1%铁氰化钾-1%三氯化铁(体积比1∶1)混合液(2.0 mL),混匀放于暗处5 min后,用0.1 mol/L盐酸稀释定容至25.0 mL,再于暗处放置20 min,以空白作对照,在最大吸收波长634 nm 处测定其吸光度。

吸取0.2 mL苦菜各部位提取液于25 mL的容量瓶中,与上述绿原酸做相同的显色处理,以70%乙醇作上述同样处理做空白,在最大吸收波长634 nm下测定其吸光度。

1.4苦菜不同部位提取液抗氧化能力的测定

[19]梯度吸取50.0μg/mL的DPPH标准溶液0、0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL分别置于试管中,用70%乙醇溶剂稀释至4 mL,摇匀,以70%乙醇作上述同样处理做空白,在最大吸收波长519 nm下测定吸光度。

取1 mL DPPH溶液于试管中,加入70%乙醇3 mL,在最大吸收波长519 nm下测定吸光度A0(溶剂与DPPH溶液混合后的吸光度);同理,取1 mL DPPH溶液于试管中,加入苦菜样品提取液3 mL,测定吸光度A1(样品与DPPH作用后的吸光度);吸取苦菜样品提取液3 mL,加入70%乙醇稀释至4 mL,测定吸光度A2(样品溶液的吸光度)。

苦菜样品对DPPH自由基的清除率(scavenging activity,SA),可表示为:

SA(%)=1-(A1-A2)/A0×100

1.5苦菜不同部位对尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响

32只小鼠随机分为模型对照组、苦菜叶组、苦菜根组和阴性对照组[14],每组8只小鼠。阴性对照组背部皮下注射0.9%氯化钠注射液,其余三组均背部皮下注射0.6 mg/mL的尼古丁溶液(小鼠尼古丁急性中毒剂量),注射量均为0.1 mL/10 g·bw。注射后即刻等体积苦菜提取液灌胃(灌胃量均为0.2 mL/10 g·bw),模型对照组和阴性对照组灌胃蒸馏水,其他组灌胃相应的苦菜样品,灌胃后45 min摘眼球取血,血液凝固后于4 ℃,3500 r/min离心15 min,分离血清,-28 ℃冰箱冷冻保存待测血清乙酰胆碱含量[14]。

表1　相关标准物质的标准曲线

表2　苦菜不同部位营养成分含量的比较(单位:mg/g)

表3　苦菜不同部位提取物抗氧化能力的比较

2　结果与讨论

2.1相关标准曲线

表1为各有效成分及抗氧化性测定的标准物质的标准曲线,可见各标准物质在测定范围内相关性良好。

2.2苦菜不同部位提取物营养成分含量

苦菜不同部位及全草提取物营养成分含量见表2,结果可知苦菜花、根、叶、茎中都含有多糖、黄酮、酚酸、皂苷等营养成分,且含量存在明显的差异。多糖、皂苷含量为根>叶>花>茎;黄酮、酚酸含量为叶>花>茎>根。苦菜全草各营养成分与叶最为相似。

从“人民群众是历史的创造者”，到“人民对美好生活的向往，就是我们的奋斗目标”，以人民为中心的发展思想，指明改革发展的力量源泉和根本目的，成为新时代改革开放的逻辑起点和强劲引擎。

2.3苦菜不同部位提取物抗氧化能力的差异性

由表3可知,苦菜不同部位及全草提取物对DPPH自由基都有一定的清除能力,苦菜各部位提取液抗氧化性强弱顺序为叶>花>茎>根;且花、茎、根抗氧化能力相差不大,根据2.2苦菜不同部位提取物营养成分含量分析,苦菜抗氧化性与苦菜黄酮、酚酸含量顺序一致、而与多糖、皂苷含量相关不大。可以初步推断其抗氧化性与苦菜黄酮、酚酸含量有关,需进一步研究。

2.4苦菜根、叶提取物对尼古丁中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响

如上所知苦菜根、叶成分相差比较大,所以主要考察苦菜根、叶提取物对尼古丁中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响,如图1所示。数据均采用SPSS 17.0数据分析软件对数据进行单因素方差分析,差异显著性水平α设为0.05。实验结果表明:方差分析结果表明苦菜叶组和苦菜根组与模型对照组小鼠血清乙酰胆碱含量之间差异显著(p<0.05),且对尼古丁中毒小鼠出现的血清乙酰胆碱含量升高有一定抑制作用。模型对照组小鼠血清乙酰胆碱含量高出阴性对照组30%,苦菜叶组和苦菜根组小鼠乙酰胆碱含量明显降低,苦菜根组小鼠乙酰胆碱含量略低于苦菜叶组,差异不大,但高于阴性对照组。根据2.2苦菜不同部位提取物营养成分含量分析,说明苦菜对尼古丁中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响主要与皂苷含量相关。

图1　苦菜根、叶对尼古丁急性中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响Fig.1　The effect of different part of Ixeris chinxensis on serum ACH content in nicotine acute poisoning mice

3　结论

苦菜不同部位多糖、黄酮、酚酸、皂苷等有效成分含量存在明显的差异;多糖、皂苷含量由大到小顺序为根>叶>花>茎;黄酮、酚酸含量为叶>花>茎>根。苦菜的花、根、叶、茎对DPPH自由基都有一定的清除能力,抗氧化能力为叶>花>茎>根,与黄酮、酚酸含量顺序一致,说明抗氧化能力与黄酮、酚酸含量有关,与多糖、皂苷相关不大;同理,苦菜根、叶提取物都对尼古丁中毒小鼠出现的血清乙酰胆碱含量升高有一定抑制作用,且相差不大,联系苦菜不同部位营养成分可推测苦菜皂苷是影响尼古丁中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的主要因素,苦菜各营养成分有待进一步提纯,深入研究其功用机理。

参考文献

[1]许光鸿. 中华苦荬菜治疗家畜烟碱中毒[J]. 中兽医学杂志,2007,139(6):26-27.

[2]Ho-Jae Lee1,Sung-Ho Hur,Eui-Cheol Shin and Yang-Bong Lee. Antioxidant and Nicotine Degradation Effects of Medicinal Herbs[J].J Food Sci Nutr,2003,l(8):289-293.

[3]H.S. Chung. Systematic Characterization of Secondary Metabolites fromIxerissonchifoliaby the Combined Use of HPLC-TOFMS and HPLC-ITMS[J]. Food SciBiotechnol,2000,9(6):364-367.

[5]朱加进,何国庆. 苦菜中防便秘抗腹泻功能因子研究[J]. 食品科学,2002,23(2):113-115.

[6]Qiusheng Z,Xiling S,Gang L,et al. Protective effects of luteolin-7-glucoside against liver injury caused by carbon tetrachloride in rats[J]. Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences,2004,59(4):286-288.

[7]霍碧姗,秦民坚. 苦苣菜属植物化学成分与药理作用[J]. 国外医药. 植物药分册,2008,23(5):203-207.

[8]冯丽,宋曙辉,赵霖等. 植物多酚及其提取方法的研究进展[J]. 中国食物与营养,2007,10:39-41.

[9]Zhang S,Zhao M,Bai L,et al. Bioactive Guaianolides from Siyekucai(Ixeris chinensis)[J]. J Nat Prod,2006(69):1425-1428.

[10]韩阳阳,王天晓,朱海芳等. 苦菜不同部位提取物的抗氧化活性[J]. 食品科学,2010,31(19):45-48.

[11]罗娟,梁建辉. 烟草及尼古丁成瘾的神经递质基础[J]. 中国药物依赖性杂志,2008,17(2):88-92.

[12]Wooltorton J R A,Pidoplichko V I,Broide R S,et al. Differential desensitization and distribution of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in midbrain dopamine areas[J]. The journal of neuroscience,2003,23(8):3176-3185.

[13]Ochoa E L M,O'Shea S M. Concomitant protein phosphorylation and endogenous acetylcholine release induced by nicotine:dependency on neuronal nicotinic receptors and desensitization[J]. Cellular and molecular neurobiology,1994,14(4):315-340.

[14]张玉芬,赵文,韩丽萍,等. 苦菜对尼古丁中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响[J]. 食品工业科技,2014,35(3):336-338.

[15]李国章,于华忠,卜晓英,等. 分光光度法测定湘产苦丁茶中熊果酸含量[J]. 光谱实验室,2006,23(2):401-404.

[16]王燕,王儒彬,田粟,等. 不同采摘期连翘叶中总黄酮、总酚酸含量与DPPH 自由基清除能力的相关性[J]. 中国实验方剂学杂志,2011,17(16):109-112.

[17]杨岚,李华峰,刁海鹏,等. 蒲公英花中总酚酸和总黄酮含量测定及其抗氧化性能研究[J]. 食品科学,2011,32(17):160-163.

[18]徐光域,颜军,郭晓强,等. 硫酸-苯酚定糖法的改进与初步应用[J]. 食品科学,2005,26(8):342-346.

[19]曲欢欢,李白雪,燕菲,等. 用清除有机自由基DPPH法评价连翘不同部位抗氧化作用[J].中国中医药信息杂志,2008,15(5):32-34.

Determination of nutritious components and physiological activities of different parts ofIxerisChinensis(Thunb.)Nakai

HUO Li1,2,SUO Ran1,NING Li1,WANG Jie1，*

(1.College of Horticulture,Agricultural University of Hebei,Baoding Hebei 071000 2.College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding Hebei 071000)

Different parts ofIxerisChinensis(Thunb.)Nakai(root,stem,leaf and flower)were extracted with 70% ethanol using ultrasonic extraction for 30 min. The contents of polysaccharide,flavonoids,phenolic acid and saponins extracted from four different parts were determined respectively. The antioxidant activity of extracts and the effect of acetylcholine content on nicotine acute poisoning in mice were investigated. The results showed that the difference was obvious among the nutritious components of different parts ofIxerisChinensis. The order of content of polysaccharide and flavonoids:root>leaf>flower>stem;the order of content of saponins and phenolic acid:leaf>flower>stem>root. The order of the antioxidant activity of the extracts:leaf>flower>stem>root. It sugessted that the antioxidant activity was mainly associated with flavonoid,phenolic acids,and the extracts had both certain inhibition to the acetylcholine on nicotine acute poisoning in mice. The results provided the theoretical base for the development ofIxerisChinensis.

IxerisChinensis;nutritious components;physiological activities

2015-03-25

霍莉 (1972-)，女，博士后，教授，研究方向：食品分析，E-mail：huolichenchen@sina.com。

王颉

河北省2012年度博士后基金(JFS-2012-13001)；国家自然科学基金(31071580)。

TS201

A

1002-0306(2016)01-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.01.000