两种方式提取杏鲍菇菌丝胞外酶的比较分析

罗卫 谢纯良 严理 朱作华 李智敏 胡镇修 彭源德

摘要：为了寻找有效提取杏鲍菇（Pleurotus eryngii Quel）菌丝胞外酶的方法，为杏鲍菇等食用菌胞外酶的活性研究和生长规律提供试验依据，研究通过pH 4.8的柠檬酸缓冲液、去离子水2种处理方式提取杏鲍菇菌丝胞外酶，并通过测定8种胞外酶酶活来对这2种方式进行比较分析。结果表明，2种提取方式对杏鲍菇菌丝胞外酶的酶活有差异，其中，酸性纤维素酶和果胶酶经酸处理酶活是水处理的2倍多;木聚糖酶和木质素降解相关酶类经酸处理的酶活也高于水处理，但淀粉酶和蛋白酶经酸处理酶活低于水处理。

关键词：杏鲍菇（Pleurotus eryngii）;胞外酶;酸处理;水处理;比较分析

中图分类号：S646.1+4          文献标识码：A          文章编号：0439-8114（2015）02-0427-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.043

Comparative Analyses of Two Methods of Extracting Extracellular Enzymes

from Pleurotus eryngii

LUO Wei，XIE Chun-liang，YAN Li，ZHU Zuo-hua，LI Zhi-min，HU Zhen-xiu，PENG Yuan-de

（Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205，China）

Abstract： In order to find effective methods of extracting extracellular enzymes from Pleurotus eryngii mycelium and provide reliable experimental basis for studying activity of extracellular enzyme and regulating growth of Pleurotus eryngii or other edible fungi， two approaches including acid（citrate buffer at pH 4.8） and distilled water process were used to extract extracellular enzymes from Pleurotus eryngii mycelium. Activities of eight extracellular enzymes were determined to compare the two methods. The results showed that the two extraction methods had significant differences in activity of extracellular enzyme. The activity of Pectinase and cellulase extracted with acid was twice as that of water. The activities of xylanase， pectinase and lignin related enzymes after acid treatment were higher than that of water. The activities of amylase and protease in acid extraction was lower than that in water extraction.

Key words： Pleurotus eryngii Qual; extracellular enzymes; acid extraction; water extraction; comparative analysis

研究食用菌胞外酶的活性，对了解不同食用菌的胞外酶分泌特点、活性大小及动态变化趋势、推测不同食用菌在不同生长发育阶段对培养基中木质纤维素、淀粉等大分子营养成分的降解动态、提高栽培技术有重要的意义[1]。在研究胞外酶活性时，能够有效提取菌丝胞外酶是测定酶活性的前提。因此，选择一种有效的提取菌丝胞外酶的方法对研究胞外酶的活性具有重要意义。目前，食用菌胞外酶的提取方法主要有2种：一是用水处理的方式提取[2-4];二是用酸处理的方式提取[5]。到目前为止，尚未见有人用同一种酶对这两种提取方式进行比较分析。由于仪器和试验操作等方面的误差，使得酸性纤维素酶、果胶酶，木聚糖酶、淀粉酶等胞外酶的提取尚无可以参考的标准。从研究的需要出发，本研究以杏鲍菇（Pleurotus eryngii Quel）菌丝为研究对象，通过酸、水2种不同的处理方式提取杏鲍菇菌丝胞外酶，并通过测定酶的活性对这2种方式进行分析比较，以期找到一种有效的提取胞外酶的方法，为今后杏鲍菇等食用菌胞外酶的提取提供理论参考。

1  材料与方法

1.1  供试菌株

杏鲍菇“杏-1”，由湖南省食用菌研究所提供，杏鲍菇栽培采用棉子壳培养基：71%棉子壳、21%麦麸、4%玉米粉、2%白糖、2%碳酸钙，自然pH，含水量60%。采用常规方式拌料、装袋，100 ℃灭菌18 h，冷却后接杏鲍菇栽培种，每一菌袋接栽培种约3 g，置入 22～25 ℃、湿度75%、CO2浓度在500～1 000 mg/kg的条件下培养，大概35 d长满菌丝[6]。

1.2  试剂

羧甲基纤维素钠、木聚糖、果胶和半乳糖醛酸为Sigma公司产品，柠檬酸、无水葡萄糖、木糖、乙酸钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、邻联甲苯胺、纤维二糖、丙二酸，丙二酸钠、ABTS、黎芦醇、果胶、硫酸锰、牛血清蛋白、PBS缓冲液、考马斯亮蓝染液、酒石酸、双氧水、酒石酸甲钠、3，5-二硝基水杨酸、可溶性淀粉为国产分析纯。

1.3  试验方法

1.3.1  粗酶液制备  菌丝长满菌袋后， 在袋中取长满菌丝的培养料充分混匀，然后取40 g均匀分成2份，一份加去离子水（以下简称水）50 mL，一份加pH 4.8柠檬酸缓冲液（以下简称酸）50 mL，20 ℃振荡浸提4 h，过滤后，4 000 r/min离心5 min，上清液即为粗酶液。

1.3.2   木质素降解相关酶类酶活测定

1）漆酶酶活的测定。相关试剂配置和酶活计算公式参照Wolfenden等[7]的方法，其酶活单位定义为1 min催化l mol底物的酶量。准确移取100 mmol/L丙二酸—丙二酸钠缓冲液、0.6 mmol/L ABTS溶液各10 mL。混合摇匀，30 ℃水浴。取上述混合试剂l mL于1.4 mL的比色皿中，420 nm处调零。准确加入待测酶液X μL（X=0～50），立即记录吸光度。每隔30 s记录1次，共3次。取平均值，折算成每分钟的吸光度变化（OD420变化）。

2）锰过氧化物酶酶活的测定。相关试剂配置和酶活计算公式参照Wariishi等[8]的方法，其酶活单位定义为l min氧化1 μmol MnSO4的酶量。准确移取100 mmol/L丙二酸—丙二酸钠缓冲液0.5 mL于1.4 mL的比色皿中，加入10 mmol/L MnSO4溶液0.1 mL，准确加入待测酶液X μL （X=0～50），加入去离子水（400-X） μL，30 ℃水浴，加入浓度为10 mmol/L H2O2溶液0.01 mL启动反应，迅速测定270 nm处的吸光度，l min后再测定1次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（OD270变化）。

3）木质素过氧化物酶酶活的测定。相关试剂配置和酶活计算公式参照Tien等[9]的方法，其酶活单位定义为1 min氧化l μmol黎芦醇的酶量。准确移取200 mmol/L酒石酸缓冲液0.5 mL于1.4 mL的比色皿中，加入40 mmol/L黎芦醇0.1 mL。准确加入待测酶液X μL （X=0～100），加入去离子水（400-X） μL，30 ℃水浴，加入浓度为20 mmol/L H2O2溶液0.01 mL启动反应，迅速测定310 nm处的吸光度，1 min后再测定1次，计算二者之差，即为每分钟的吸光度变化（OD310变化）。

1.3.3  酸性纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶酶活的测定

1）酸性纤维素酶酶活的测定。相关溶液和试剂的配置参照Mandels等[10]的方法，取3支试管各加入0.5 mL酸性CMC底物，与待测酶液一起在50 ℃水浴中预热5 min。在第一、二支试管中各加入0.5 mL待测酶液，50 ℃水浴中反应15 min。在3支试管中各加入3 mL的DNS试剂，然后在第三支试管中加入0.5 mL的待测酶液。摇匀3支试管后，在沸水浴中煮5 min。水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在540 nm下测第一、二支试管的吸光度。酶活（IU/mL）=（葡萄糖等量值/180/15/0.5）×稀释倍数。

2）果胶酶酶活的测定。相关溶液和试剂的配置参照王玉万等[11]的方法，取3支试管各加入0.5 mL 0.25%聚半乳糖醛酸溶液，与待测酶液一起在50 ℃水浴中预热5 min。在第一、二支试管中各加入0.5 mL待测酶液，50 ℃水浴中反应15 min。在3支试管中各加入3 mL的DNS试剂，然后在第三支试管中加入0.5 mL的待测酶液。摇匀3支试管后，在沸水浴中煮5 min。水浴冷却至室温后，将空白液置4 000 r/min离心机中离心5 min后取上清液作为空白对照。以第三支试管为对照在540 nm下测第一、二支试管的吸光度。酶活（IU/mL）=（葡萄糖等量值/180/15/0.5）×稀释倍数。

3）木聚糖酶酶活的测定。相关溶液和试剂的配置参照Shamala等[12]的方法。采用DNS法，取3支试管各加入0.5 mL中性木聚糖底物，与待测酶液一起在50 ℃水浴中预热5 min。在第一、二支试管中各加入0.5 mL待测酶液，50 ℃水浴中反应15 min。在三支试管中各加入3 mL的DNS试剂，然后在第三支试管中加入0.5 mL的待测酶液。摇匀3支试管后，在沸水浴中煮10 min。水浴冷却至室温后，将显色液（包括空白）以4 000 r/min离心5 min。取上清液以第三支试管为对照在540 nm下测第一、二支试管的吸光度。酶活（IU/mL）=（葡萄糖等量值/150/15/0.5）×稀释倍数。

1.3.4   淀粉酶、蛋白酶酶活的测定

1）淀粉酶酶活的测定。相关溶液和试剂配置参照管道平[5]的方法，在3支试管中加入1%可溶性淀粉溶液1 mL，加入pH 4.8、0.1 mol/L柠檬酸缓冲溶液4 mL，去离子水1 mL，在第一、第二支试管中加入酶液l mL，40 ℃水浴中保温30 min。在3支试管中各加入3 mL的DNS，然后在第三支试管加入1 mL的酶液。摇匀3支试管在沸水浴中煮5 min。水浴冷却至室温后，以第三支试管为对照在540 nm下测第一、二支试管的吸光度。酶活单位定义为每小时酶促生成l mg葡萄糖的酶量。

2）蛋白酶酶活的测定。相关溶液和试剂的配置参照Bradford[13]的方法，将适当体积的样品加入到试管中，并用PBS补足到150 μL，向各试管中加入2.85 mL的考马斯亮蓝染液，混匀，温室放置5～10 min，用分光光度计测定595 nm处的吸光度，并记录读数，以不含BSA的样品作为空白对照，绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。

2  结果与分析

2.1  木质素降解相关酶类酶活测定结果

木质素降解相关酶类经酸、水处理后所测得的酶活如表1和图1所示。由图1可知，木质素相关酶类酶活酸处理与水处理相比有差异，酸处理酶活均高于水处理酶活。

2.2   酸性纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶酶活测定结果

酸性纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶经酸、水处理后所测得的酶活如表2和图2所示。由图2可知，杏鲍菇菌丝经酸处理酶活与水处理相比有显著差异，其中酸性纤维素酶酸处理酶活是水处理的2倍多;果胶酶酸处理酶活是水处理的2倍多，木聚糖酸处理酶活是水处理的1倍多。

2.3  淀粉酶、可溶性蛋白酶酶活测定结果

淀粉酶、可溶性蛋白酶经酸、水处理后所测得的酶活如表3和图3所示。由图3可知，杏鲍菇菌丝酸处理酶活与水处理相比有差异，酸处理酶活低于水处理。

3  小结与讨论

本研究采用2种不同的处理方式提取杏鲍菇菌丝胞外酶，并对2种处理方式的结果进行比较分析。试验结果表明，酸性纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶、漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶经酸处理后测定的酶活与水处理相比有差异，其中酸性纤维素酶、果胶酶、木聚糖酶酸处理酶活与水处理相比有显著的差异。但淀粉酶和蛋白酶的酸处理酶活不及水处理效果，初步分析，可能是淀粉酶和蛋白酶的最适pH接近中性，而pH 4.8的柠檬酸缓冲液偏酸性，抑制了部分淀粉酶和蛋白酶的活性，从而导致所测得酶活低，但是具体的反应机理还需进一步研究。

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