中药材鬼针草的定性和定量研究*

布紫云　曲婷丽　赵正保



【实验研究】

中药材鬼针草的定性和定量研究*

布紫云曲婷丽赵正保△

山西医科大学药学院(太原 030001)

摘要：目的初步建立中药材鬼针草的质量标准。方法以芦丁和金丝桃苷为对照品，对鬼针草药材分别采用薄层色谱法和高效液相色谱法进行定性和定量研究。结果建立了以薄层色谱法鉴别鬼针草药材中芦丁和金丝桃苷的方法。芦丁的线性范围为 3.11～99.55 μg·mL-1，回归方程为：Y=16.783X-7.895(r = 0.9999，n = 6)，平均加样回收率为 96.75%，RSD为2.77%(n = 6)；金丝桃苷的线性范围为 3.14～100.6 μg·mL-1，回归方程为 Y= 22.425X - 10.389(r = 0.9998，n = 6)，平均加样回收率为 94.89%，RSD为 1.98%(n = 6)。 结论本实验方法简单，准确，重复性好，可用于鬼针草的定性鉴别和定量测定，有效控制鬼针草药材的质量。

关键词：鬼针草；薄层色谱法；高效液相色谱法；芦丁；金丝桃苷

鬼针草(BidenspilosaL.)为菊科鬼针草属一年生草本植物，又名鬼钗草、粘身草、三叶鬼针草。是我国民间常用药，史载于唐朝陈藏器《本草拾遗》，具有清热解毒，活血散瘀之功效，多用于上呼吸道感染，咽喉肿痛，疟疾，急性黄疸型肝炎，跌打肿痛等[1]。鬼针草所含成分复杂多样，主要活性成分为黄酮类化合物，曹园等[2]从鬼针草 95% 乙醇提取物中分离出18个化合物，分别为芦丁、金丝桃苷、槲皮素、木犀草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等成分。本文建立薄层层析法和高效液相色谱法对鬼针草中黄酮类活性成分芦丁和金丝桃苷进行定性鉴别和定量测定，为有效控制鬼针草药材的质量提供依据。

1　材料

1.1仪器Agilent 1200 型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司)，TU-1901 型双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，AL-104 型电子分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)，SB5200-DTDN 型超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)，硅胶 G 板(薄层色谱用，青岛海洋化工厂)。

1.2药材鬼针草药材 8 批，分别采集于山西运城，安徽亳州，福建宁德等地(批号分别为Y2013001-Y2013003，B2013001-B2013003，201401)，购买于山西太原国药集团(批号201309，产地河北安国)。经山西医科大学药学院中药系白云娥副教授鉴定为菊科植物鬼针草BidenspilosaL. 的干燥地上部分。

芦丁对照品(批号 10080-200707，购于中国食品药品检定研究院)，金丝桃苷对照品(批号 11521-201205，购于中国食品药品检定研究院)。甲醇、乙腈(色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司)，无水乙醇、乙酸乙酯、甲酸、磷酸等(分析纯，天津市北辰方正试剂厂)。

2　试验方法与结果

2.1薄层鉴别

2.1.1供试品溶液的制备取本品粉末 5.0 g，加甲醇 50 mL，加热回流 2 h，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯 10 mL 使溶解，用蒸馏水萃取 2 次，每次 10 mL，合并水层，蒸干，残渣加甲醇约 5 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.1.2对照品溶液的制备取芦丁对照品和金丝桃苷对照品适量，加甲醇制成每 1 mL各含 0.2 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.3薄层色谱条件参照薄层色谱法[3](附录Ⅵ B)试验，吸取对照品和供试品溶液各 5 μL，点于同一硅胶 G 薄层板上，以乙酸乙酯：丁酮：甲酸：水(5：3：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，干燥后置于紫外光灯下(365 nm)观察特征斑点颜色。结果显示在与对照品色谱相应的位置上，显示相同的黄色荧光斑点。

1 金丝桃苷；2 芦丁；3-10 鬼针草供试品图1　薄层色谱鉴别结果

2.2含量测定

2.2.1测定波长的选择取芦丁和金丝桃苷对照品溶液，采用紫外可见分光光度法从 200～760 nm范围内进行扫描，结果显示，芦丁和金丝桃苷在 362 nm处有强吸收峰，故选择 362 nm为检测波长。

2.2.2色谱条件和系统适应性试验Welch Ultimate LP- C18 色谱柱(250 mm×4. 6 mm，5×m)；流动相：乙腈：0.1% 磷酸水溶液(17.5：82.5)；流速：1.0 mL· min-1；检测波长：362 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在此色谱条件下，取对照品溶液、供试品溶液各 10 μL，分别进样，记录色谱图，见图1。理论塔板数按芦丁计算不低于 3000。芦丁和金丝桃苷与其它组分离良好。

图2　对照品和鬼针草药材的HPLC

2.2.3对照品溶液的制备精密称定芦丁对照品 2.75 mg，金丝桃苷对照品 2.70 mg，置 25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，作为对照品储备液，每 1 mL含芦丁为 99.55 μg，含金丝桃苷为 100.6 μg。

2.2.4供试品溶液的制备取 105 ℃下干燥后的鬼针草药材粉末约 1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加70% 的乙醇 60 mL，密塞，于 40 ℃下超声处理(功率 250 W，频率 40 kHz)20 min，放冷，摇匀，滤过，洗涤残渣和滤纸。回收溶剂，加甲醇溶解，定容至 10 mL 容量瓶中。用 0.45 μm 的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.5线性关系考察取混合对照品储备液，精密量取 0.3、0.6、1.3、2.5、5.0 mL，分别置于10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。在上述色谱条件下分别进样10 μL。以峰面积(Y)为纵坐标，浓度(X，μg·mL-1)为横坐标，绘制标准曲线。芦丁回归方程为：Y=16.783X-7.895(r= 0.9999，n= 6)，金丝桃苷回归方程为Y= 22.425X- 10.389(r= 0.9998，n= 6)。表明芦丁在 3.11～99.55 μg·mL-1，金丝桃苷在3.14～100.6 μg·mL-1范围内具有良好的线性关系。

2.2.6精密度试验精密吸取同一对照品溶液(芦丁浓度为 12.44 μg·mL-1)10 μL，在上述色谱条件下重复进样 6 次，芦丁峰面积平均值为 196.77，RSD 0.89%，金丝桃苷峰面积平均值为 264.60，RSD 0.89%。表明仪器精密度良好。

2.2.7稳定性试验取同一供试品溶液(批号：201309)，分别于0、2、4、8、12 及 24 h 各进样 1 次，测得峰面积值，芦丁峰面积平均值为 160.8，RSD 2.38%，金丝桃苷峰面积平均值为 190.78，RSD 2.25%。表明供试品溶液在 24 h 内稳定性良好。

2.2.8重复性试验取同一批鬼针草药材(批号：201309)约 1.0 g，精密称定，平行制备 6份供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析。芦丁平均含量为 100.6 μg·g-1，RSD 2.49%；金丝桃苷平均含量为 90.79 μg·g-1，RSD 2.31%。

2.2.9加样回收率试验取已知含量的鬼针草样品(批号：201309，芦丁含量为 100.6 μg·g-1，金丝桃苷含量为 90.79 μg·g-1)6 份，每份 0.5 g，精密称定，分别精密加入 0.5 mL的混合对照品储备液(芦丁浓度为 99.55 μg·mL-1，金丝桃苷浓度为 100.6 μg·mL-1)，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进样分析。芦丁平均加样回收率为 96.75%，RSD 2.77%，金丝桃苷平均加样回收率为 94.89%，RSD 1.98%。结果见表1和表2。

表1　芦丁回收率测定

表2　金丝桃苷回收率测定

2.2.10芦丁和金丝桃苷的含量测定取 105 ℃ 下干燥后的鬼针草药材，每份约 1.0 g，精密称定，按“2.2.4”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行 HPLC 分析，8批样品芦丁含量不低于73.94μg·g-1，金丝桃苷含量不低于93.46μg·g-1，结果见表 3。

表3　8批样品的含量测定结果

3　讨论

在薄层鉴别[4]中，先后采用了乙酸乙酯-乙醇-水(10：5：3)、乙酸乙酯-甲酸-水(8：1：1)、乙酸乙酯-乙酰丙酮-冰乙酸-水(2：1.5：0.2：0.5)、乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5：3：1：1)等展开剂，结果显示在乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5：3：1：1)展开系统中，芦丁和金丝桃苷斑点清晰，分离效果良好。

在含量测定供试品制备工艺考察中，比较了不同提取方法(回流提取、超声)，不同提取溶剂(甲醇、60% 乙醇、70% 乙醇、80% 乙醇)，不同提取时间(20 min、30 min、40 min)，溶剂用量(40 mL、50 mL、60 mL)对试验结果的影响，结果显示70% 的乙醇 60 mL，超声处理 20 min，芦丁和金丝桃苷的含量均最高。

在选定波长时，芦丁和金丝桃苷在 258 nm 和 362 nm 处均有强吸收，但 362 nm 处色谱图峰形好，干扰少，故选择 362 nm 为检测波长。试验先后进行了乙腈-0.1% 甲酸溶液、乙腈-0.6% 磷酸溶液、甲醇- 0.04% 磷酸溶液、乙腈-0.1% 磷酸溶液等多种流动相系统[5]，最终确定流动相为乙腈-0.1% 磷酸溶液(17.5：82.5)，此时芦丁和金丝桃苷与杂质峰分离度良好，且相互之间无影响。

鬼针草主要活性成分为黄酮类，主要有芦丁、海生菊苷、金丝桃苷、异槲皮苷等，研究表明鬼针草中的黄酮类成分有减轻大鼠内毒素性急性肺损伤，降低氧化应激损伤程度，并对肝纤维化大鼠具有防治作用等多种药理活性[6]，本法对其黄酮类成分芦丁和金丝桃苷采用高效液相色谱法进行了含量测定，结果准确可靠，方法简单、灵敏，可用于鬼针草的质量控制。鬼针草中含有的聚炔类成分鬼针聚炔苷和鬼针聚炔苷B是其抗癌的活性成分，对体外培养的 HL-60、V937白血病细胞有明显的抑制作用[7],张丽等[8]利用自制的鬼针聚炔苷对照品对其进行了含量测定。本实验未能获得符合含量测定用的鬼针聚炔苷对照品，故未测定其中含量。

参考文献

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志第75卷[M].北京:科学出版社，1979：377.

[2]曹园，瞿慧，姚毅，等.鬼针草化学成分研究[J].中草药，2013，44(24)：3435-3439.

[3]国家药典委员会. 中华人民共和国药典一部[S]. 北京：北京中国医药科技出版社，2010，附录Ⅵ B.

[4]田月琴，刘锐玲，李飞飞，等.海桐皮及其易混品的比较鉴别[J].光明中医，2014，29(12)：2530-2533.

[5]李玉兰，李军，王乃利，等. RP-HPLC法测定小花鬼针草中原儿茶酸、芦丁、金丝桃苷和槲皮苷的含量[J]. 沈阳药科大学学报，2009，26(8)：639-643.

[6]赵喜兰，刘秋鹤. 鬼针草总黄酮对大鼠内毒素性急性肺损伤的影响[J]. 中国实验方剂学杂志，2012，18(24)：265-268.

[7]王建平，秦红岩，张惠云，等. 鬼针草提取成分对白血病细胞的体外抑制作用[J]. 中药材，1997，20(5)：247-248.

[8]张丽，徐国兵，陈飞虎，等. 高效液相色谱法同时测定鬼针草提取物中 3 种单体成分的含量[J]. 中国药学杂志，2011，46(22)：1759-1761.

*基金项目：山西省中药材中药饮片地方标准研究项目基金“鬼针草地方标准研究” (No.2013001A)

通讯作者△

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.02.028

文章编号：1003-8914(2016)-02-0211-03

收稿日期：(本文校对：刘言言2015-03-19)

Qualitative and Quantitative Study onBidenspilosaL.

BU ZiyunQU TingliZHAO Zhengbao△

(School of Pharmaceutical Science, Shanxi Medical University, Shanxi, Taiyuan 030001, China)

Abstract：ObjectiveTo establish the quality standard for bidens pilosa L.. MethodsTaking rutin and hyperoside as references, Bidens pilosa L. was identified by TLC, and the content of rutin and hyperoside were determined by HPLC. ResultsThe identifying method of rutin and hyperoside by TLC were established. The determination method for the content of rutin and hyperoside was established. The calibration curve of rutin was liner in the range of 3.11～99.55 μg·mL-1. The regression equation was Y=16.783X-7.895 (r=0.9999，n=6). The average recovery was 96.74%, RSD was 2.76% (n=6). The calibration curve of hyperoside was liner in the range of 3.14～100.6 μg·mL-1. The regression equation was Y=22.425X-10.389 (r=0.9998, n=6). The average recovery was 94.89%, RSD was 1.98% (n=6). ConclusionThe method is simple and accurate, and has high reproducibility. It can effectively control the quality of bidens pilosa L. by qualitative identification and quantitative determination.

Key words：Bidens pilosa L.; TLC; HPLC; Rutin; Hyperoside