芦丁稀土钐配合物的自由基清除及抑菌作用

林建原，陆 兴

浙江万里学院生物与环境学院，宁波 315100

稀土是化学元素周期表中的镧系元素以及与镧系的15个元素密切相关的两个元素—钪和钇共17种元素［1］。稀土元素具有特殊的理化性质，在石油化工、玻璃陶瓷、环境保护、医药等方面有广泛的应用［2］。近年来，随着人们对稀土元素的深入研究，发现稀土元素具有特殊的生物学效应［3］。芦丁是一种黄酮类化合物，在植物体中的根、茎、叶、种子、果实中广泛存在［4］，例如芸香科的芸香草，豆科的槐米，蓼科的荞麦等都含有芦丁［5］，可用于防治脑溢血、视网膜出血、高血压、急性出血性肾炎，治疗风湿性头痛等。目前，国内外学者对于芦丁的抗氧化性和清除自由基活性已有深入研究，但对芦丁及其稀土配合物的相关研究鲜见报道。本文合成了芦丁稀土钐配合物，测定了芦丁及其配合物清除自由基的能力，同时通过对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑菌实验，研究芦丁及其稀土配合物的抑菌性能。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 实验仪器

F-4500型荧光分光光度计(日本日立公司);HH-2数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司);DZF-6020真空干燥箱(上海慧泰仪器制造有限公司);SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(上海青浦沪西仪器制造有限公司);UV-3200PCS紫外分光光度计(上海美普达仪器有限公司);AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司);DL-1电炉(上海锦凯科学仪器有限公司);TC-15套式恒温器(新华医疗器械厂);SW-CJ-ICU无菌操作台洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司);Vertex 70傅立叶红外光谱仪(德国Bruker公司);游标卡尺。

1.1.2 试剂及配制

芦丁(BR，国药集团化学试剂有限公司);氧化镧(99.99%，阿拉丁);无水乙醇(AR);浓盐酸(AR);双氧水(AR);小牛浸膏(杭州微生物实际有限公司);蛋白胨(BR，上海展云化工有限公司);NaCl(99.5%);琼脂(BR，上海展云化工有限公司);无水 Na2CO3(AR);KBr(AR);苯甲酸钠(AR，);邻苯三酚(AR);硫酸亚铁铵(AR);Tris(三羟甲基氨基甲烷，BR，国药集团化学试剂有限公司);EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙醚)四乙酸，AR);DPPH·(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，96%，阿拉丁)，合成的钐芦丁配合物和芦丁分别用二甲基亚砜溶解，EGTA用氢氧化钠溶解，DPPH·用无水乙醇溶解。

1.2 试验部分

1.2.1 芦丁-钐配合物的合成

称取适量氧化钐于一小烧杯中，加双氧水3～5 mL，逐滴滴加1∶1盐酸至固体氧化钐全部溶解，在水浴锅中加热至基本无气泡，将溶液在电炉上蒸干，除去过量的双氧水、盐酸以及多余的水分得到稀土氯化物粉末，蒸去。

称取1 mmol芦丁，加100 mL无水乙醇，微热搅拌使芦丁溶解，向芦丁乙醇溶液中加入适量的2.0 mmol无水碳酸钠，2.2 mmol稀土氯化物粉末，在100～110℃回流4 h，抽滤，经无水乙醇洗涤固体2～3次，放入真空干燥中60℃下干燥至恒重得到棕黄色固体。

1.2.2 羟基自由基(·OH)清除活性［6］

在烧杯中依次加入0.4 mL 3.8 mmol/L的EGTA(乙二醇二乙醚二胺四乙酸)、0.2 mL 0.01 mol/L的苯甲酸钠溶液、3.2 mL的蒸馏水、2 mL 3.8 mmol/L的硫酸亚铁铵溶液、0.2 mL的双氧水，快速摇匀并且倒入石英比色皿中，以300 nm为激发波长，415 nm为发射波长，立即测定在此波长处的荧光强度，绘制动力学曲线，该曲线于0～6 min部分的斜率为k0。

芦丁和芦丁-钐配合物的荧光动力学曲线测定:分别配制6种不同浓度的芦丁和芦丁-钐配合物浓度，按照上述试剂加入顺序，蒸馏水加入量依次变为3.0、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0 mL，且在加入双氧水之前分别加入样品 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，用2.2.2同方法测定该曲线0～6 min的斜率为k。以下列公式计算芦丁和芦丁-钐配合物对羟基自由基的抑制率:

研究氧自由基的清除有直接法和间接法［9］。在烧杯中依次加入4 mL的Tris.HCl缓冲液、1.4 mL的蒸馏水、0.6 mL的邻苯三酚，快速摇匀并且倒入石英比色皿中，以448 nm为激发波长，500 nm为发射波长，立即测定在此波长的荧光强度，绘制动力学曲线，该曲线0～6 min部分的斜率为k0。

测定芦丁和芦丁-钐配合物的荧光动力学曲线:分别配制6种不同浓度的芦丁和芦丁-钐配合物，用上述同方法测定，该曲线0～6 min部分的斜率为k。按下列公式计算芦丁和芦丁-钐配合物对氧自由基的抑制率:

1.2.4 DPPH·自由基清除活性［6］

取2.0 mL 0.3 mmol/L的DPPH·自由基，加蒸馏水定容至10 mL。放置30 min，以蒸馏水为空白，测定517 nm波长处的吸光度，此为A0，另取12个比色管，加入2.0 mL的DPPH·自由基和不同量的样品液，用蒸馏水定容至10 mL，按上述相同方法测定其吸光度，此为A，按下列公式计算芦丁和芦丁-钐配合物对DPPH·自由基的抑制率:

1.2.5 抑菌能力

1.2.5.1 制备培养基［7］

称取蛋白胨10 g，氯化钠5 g，牛肉膏3 g，琼脂15～20 g于烧杯中，加入蒸馏水1000 mL用电炉加热溶解至颜色呈透明，在加热过程中不断用玻璃棒搅拌，用氢氧化钠或盐酸调节pH至7.2～7.4，倒入锥形瓶中在121℃高压灭菌锅中灭菌30 min备用。

1.2.5.2 接种

将培养基加入1000 mL锥形瓶中，在121℃灭菌后倒平板放到37℃培养箱中培养24 h，去除染菌的培养基，然后在无菌室内接入大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。接种完毕后在37℃培养箱中培养24 h。

1.2.5.3 抑菌试验

(1)样品的制备:将芦丁用乙醇溶解，配制浓度为2.6 mg/mL的溶液，芦丁-钐配制成2.5 mg/mL浓度的溶液。

(2)纸片的制备:剪取直径约6 mm的纸片在121℃的灭菌锅中灭菌后，于无菌室中将纸片分别浸泡于蒸馏水、DMSO溶液，芦丁、芦丁-稀土钐中，取出置干燥箱中干燥后保存。

2 结果与分析

2.1 配合物的光谱表征

2.1.1 红外光谱分析

用KBr压片法测得芦丁-钐配合物和芦丁的红外特征吸收光谱，见图1。

图1 芦丁-钐配合物(1)与芦丁(2)的红外光谱Fig.1 The IR-VIS spectra of Rutin-Sm complex(1)and rutin(2)

由表1的主要吸收频率可知，芦丁和芦丁-钐在3378 cm-1处出现的宽峰主要为水及醇、酚羟基的伸缩振动吸收峰。由于芦丁带有多个羟基，生成配合物时对此峰基本无影响［8］。芦丁在1655.36 cm-1处出现的羰基伸缩振动吸收峰，在芦丁-钐配合物中，该峰向低波数区位移到1624.51 cm-1处，向低波数位移了30 cm-1，这说明羰基参与了配位反应［9］，配位作用使C=O键减弱，相应吸收峰向低波数位移。芦丁-钐中苯环兀键共轭体系的C=C键伸缩振动吸收峰，向低波数方向位移40 cm-1，是配位反应对苯环共轭体系的影响所致。芦丁在1362.31、1296.21 cm-1处的两个谱峰是酚羟基的C-O键伸缩振动与O-H键面内变形振动偶合所致。配合物中这两个峰均出现在1355.22、1273.00 cm-1处，均向低波数方向位移分别为7.23 cm-1，说明酚羟基参与了配位成键。配体在1203.99 cm-1到1168.78 cm-1处的吸收峰是醚的C-O-C伸缩振动吸收峰，配合物中此峰基本保留在原来的位置，排除了醚氧原子成键的可能。

表1 芦丁和芦丁-钐的主要红外吸收频率Table 1 Principal characteristic IR absorption frequency of rutin and Rutin-Sm complex

2.1.2 紫外吸收光谱分析

图2 芦丁和芦丁-钐配合物的紫外吸收光谱Fig.2 UV-VIS spectra of rutin and Rutin-Sm complex

由紫外吸收光谱分析的吸收数据可知，在芦丁-钐中存在桂皮酰基和苯甲酰基，因此有两个主要的紫外吸收峰Ⅰ和Ⅱ，图2所示。实验表明，形成稀土钐-芦丁配合物后，带Ⅰ、带Ⅱ的吸收峰发生了红移，两者比较发现，芦丁-钐配合物和芦丁的紫外吸收峰的位置和强度均有改变，表明稀土离子和配体之间确有键合作用。

2.2 清除自由基活性

2.2.1 清除·OH自由基活性

按1.2.2方法，采用Fenton反应生成羟基自由基，再与苯甲酸反应，生成的羟基苯甲酸具有较强的荧光效率，可以通过测定羟基苯甲酸的生成速率间接测定羟基自由基的生成速率，其中Fenton反应式为:Fe2++H2O2=Fe3++ ·OH+OH-。

如图3所示，随着加入芦丁和芦丁-钐浓度的增加，抑制率也随之增加。芦丁-钐配合物和芦丁均具有清除·OH的能力，且配合物的清除能力强于芦丁。

图3 芦丁及芦丁钐配合物对羟基自由基(·OH)的抑制率Fig.3 Scavenging activities of rutin and Rutin-Sm complex on Hydroxyl radicalp

利用分光光度法测定邻苯三酚自氧化产物随时间的变化曲线。按1.2.3实验方法分别测定芦丁-钐配合物及芦丁清除的能力。图4所示，芦丁-稀土钐配合物及芦丁清除氧自由基的能力随着含量的增大而增大，且配合物清除能力明显强于芦丁。

图4 芦丁及芦丁钐配合物对超氧自由基)的抑制率Fig.4 Scavenging activities of rutin and Rutin-Sm complex on superoxide anion radical

2.2.3 清除DPPH·活性

DPPH·是一种较稳定的自由基，在乙醇溶液中显紫色，在吸收波长517nm处吸收强度最大。当自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子配对，DPPH·浓度减小而使其颜色变浅，吸光度也减小。按1.2.4实验方法分别测定了芦丁-钐配合物和芦丁对DP PH·自由基的抑制作用，如图5所示。且配合物清除DPPH·自由基的能力高于芦丁。

图5 芦丁及芦丁钐配合物对DPPH·自由基的消除率Fig.5 Scavenging activities of rutin and Rutin-Sm complex on DPPH·radical

2.3 抑菌能力分析

2.3.1 抑菌圈的测定:在无菌室中，将培养好的大肠杆菌菌种涂布于培养基表面，然后分别将用蒸馏水、DMSO、芦丁和芦丁-钐浸泡过的滤纸片放入不同的培养基中。在37℃的培养箱中培养12 h后观察。金黄色葡萄球菌的操作如同。用游标卡尺测量抑菌圈的大小。

表2 抑菌圈大小(d=mm)Table 2 Inhibition zone(d=mm)

由表2可知，芦丁及芦丁-稀土钐配合物能抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，由抑菌圈直径可知配合物芦丁-钐的抑菌活性强于芦丁。

2.3.2 最低抑菌浓度的测定:将浓度为2.6 mg/mL的芦丁溶液依次稀释，将溶液用无菌吸量管取一定量加入培养基中涂匀培养基，用接种环将配置好的2种菌液分别接种于对应的培养基中放入37℃恒温箱中培养。芦丁-钐的操作同上。用肉眼观察完全没有菌落生长的最低溶液浓度作为最低抑菌浓度(MIC)。

表3 最低抑菌浓度的抑菌能力Table 3 Antibacterial activity of minimum inhibition concentration

“-”代表“不长菌”;“+”代表“长菌”。“-”means“no bacterium grow”;“+ ”means“have bacterium grow”.

由表3可知，芦丁-钐配合物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度可达2.6×10-3mg/mL。在低浓度下所得稀土芦丁配合物仍然具有明显的抑菌活性，表明芦丁-钐的抑菌活性强于芦丁。

2.3.3 最低杀菌浓度的测定:从抑菌实验“不长菌”培养基中，取出一定量培养物接种到不含其它样品的培养基中，涂匀培养基，置于37℃培养箱中培养12 h。观察有无菌落生长，少于5个菌落的为最低杀菌浓度(MBC)。

表4 最低杀菌浓度测定Table 4 Determination of Minimum bactericidal concentration

根据抑菌圈大小可以初步确定物质的抑菌能力大小，抑菌圈直径越大表明抑菌活性越高，表4可知芦丁和芦丁-钐配合物浓度较高时，具有强抑菌作用。且稀土芦丁-钐配合物的抑菌效果明显大于芦丁，且对金黄色葡萄球菌抑菌活性强于大肠杆菌的抑菌活性。原因可能是由于芦丁和配合物与肽链和细胞磷脂上的羧基具有较强的亲和力，可以与菌的转移核糖核酸中的磷酰基键合，抑制其核酸酶的活性以及功能，使细菌的生长受到抑制而达到抑菌效果;另由于芦丁和钐形成配合物后，配合物的分子量变大，脂溶性随之增强，同时对细胞膜的穿透力增强，使生物体生长以及代谢需要的关键成分都流失，破坏生物体正常运转活动［8］，芦丁和芦丁-钐配合物的抑菌效果就是由于此原因而体现出来。

3 结论

实验选用菌种革兰氏阴性菌(大肠杆菌)、革兰氏阴性菌(金黄色葡萄球菌)进行抑菌实验，实验发现，稀土钐芦丁配合物的抑菌效果随配合物浓度的增加，抑菌活性显著增大，最低抑菌浓度可达2.6×10-3mg/mL。通过荧光动力学曲线发现芦丁和芦丁-钐配合物对DPPH·自由基、·OH自由基及O-·2自由基均有一定的清除能力。

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