艾灸对克罗恩病大鼠穴区TRPV表达的影响*

洪　珏　魏　凯　张　丹　张琳琳　刘　婕



艾灸对克罗恩病大鼠穴区TRPV表达的影响*

洪珏1魏凯2张丹1张琳琳3刘婕1

1.上海市针灸经络研究所(上海 200030)；2.复旦大学上海医学院博士研究生2013级(上海 200032)；3.安徽省阜阳市人民医院(阜阳 236000)

摘要：目的观察隔药灸对炎症性肠病大鼠天枢穴区TRPV1、TRPV3蛋白表达的影响，探讨隔药灸治疗炎症性肠病的穴位局部启动机制。方法采用雄性清洁级SD大鼠建立炎症性肠病模型。将大鼠随机分为正常组、模型组、模型隔药灸组、正常隔药灸组。正常组、模型组不予任何治疗；模型隔药灸组和正常隔药灸组均取天枢穴施以隔药灸干预。干预结束后，采用免疫组织化学法(Immunohistochemistry)检测各组大鼠天枢穴区TRPV1、TRPV3蛋白的表达。结果隔药灸干预后，模型隔药灸组TRPV1蛋白的表达水平显著高于正常组、正常隔药灸组(均P<0.01)以及模型组(P<0.05)；模型组与模型隔药灸组TRPV3蛋白表达水平均显著高于正常组(P<0.05)。结论调节穴区TRPV1、TRPV3可能是隔药灸治疗炎症性肠病的穴位局部启动机制之一。

关键词：针灸疗法；间接灸；炎症性肠病；TRPV

瞬时感受器电位(Transient Receptor Potential, TRP)家族能够感受温度变化，目前认为TRP蛋白是哺乳类动物躯体感觉系统感受温度刺激的初级分子换能器。瞬时受体电位香草酸亚型(Transient Receptor Potential Vanilloid, TRPV)是TRP 7个亚族之一，其成员中与温热刺激相关的主要是TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4[1～5]。在艾灸疗法产生效应的作用中，温热刺激是其中的重要因素[6～7]。结合艾灸温度特点和TRPV家族的激活温度范围及分布特点，笔者认为TRPV家族在艾灸的局部启动机制中扮演着重要角色，尤其是TRPV1、TRPV3[1]。近年来，艾灸疗法治疗炎症性肠病的临床疗效已被证实，然而艾灸疗法的起效机制尚未阐明。本实验通过观察隔药灸对炎症性肠病大鼠天枢穴区TRPV水平的影响，探讨隔药灸的起效机制。

1　材料与方法

1.1实验动物体质量为(120±20)g的雄性清洁级Sprauge-Dawley(SD)大鼠40只，由复旦大学附属上海医学院动物实验中心提供(动物合格证编号：2009001901205)。所有动物购回后室温适应性喂养3 d，无不良反应，饮食饮水正常者纳入实验。该实验中所有操作均遵照动物伦理委员会相关规定。

1.2器械、药品和试剂

1.2.1器械与药品特级艾绒(南阳绿莹艾草生物制品有限公司)；自制药粉(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院药剂科提供)；旋涡振荡器(Vortex，XW-80A，上海青浦泸西仪器厂)；手握式电动匀浆机(FLUKO，F6-10，德国FLUKO)；干式恒温器(K10CD，杭州蓝焰科技有限公司)；低温冷冻离心机(1-15K，3K15，Sigma美国)；生物安全柜(TYPE B2，Sigma美国)；紫外杀毒车(ZXC型，上海跃进医用光学器械厂)。

1.2.2试剂三硝基苯磺酸(Trinitrobenzene Sulfonic Acid, TNBS)(美国Sigma公司)；无水乙醇(上海振兴化工一厂)；Masson染色试剂盒(上海仁宝医用试剂研究有限公司)。焦碳酸二乙酯(DEPC)(上海生物工程技术公司)；DEPC处理水(上海赛百盛基因公司)；氯仿HPLC级(上海试剂一厂)；异丙醇HPLC级(苏州振亚化工厂)；无水乙醇AR级(上海振兴化工一厂)。

1.3炎症性肠病模型制作[8～11]应用TNBS灌肠制备炎症性肠病(克罗恩病)运动模型。将5%的TNBS和50%的乙醇，按2：1比例混合成TNBS灌肠液。造模前，各组大鼠禁食、不禁水饲养24 h，造模组根据大鼠体质量按30 mg/kg剂量予1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，麻醉成功后取大鼠垂直倒立体位，根据大鼠体重，按0.5 mL/kg 剂量予TNBS灌肠液直肠灌注造模，每星期1次，共4次。经病理组织学检测验证模型制备成功后，第二天开始进行治疗干预。

1.4分组处理将大鼠随机分为正常组(A组)、模型组(B组)、模型隔药灸组(C组)、正常隔药灸组(D组)。A组：只做与其他组相同的固定，不治疗。B组：造模成功后，只做与其他组相同的固定，不治疗。C组：造模成功后，取双侧天枢穴予以隔药灸治疗。将中药粉末(附子、肉桂、丹参等)用黄酒调成糊状，压成直径5 mm、厚3 mm的药饼，选用精制艾绒约90 mg制成椎体状艾炷，每次每穴各灸2壮，每日1次，共灸7 d。D组：取双侧天枢穴予以隔药灸干预，方法同模型隔药灸组。

1.5标本采集治疗结束后，大鼠24 h禁食、不禁水，根据大鼠体质量，按照30 mg/kg的剂量予1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，分离天枢穴区皮肤直径约1 cm。右侧天枢穴区皮肤组织以10%的中性缓冲福尔马林溶液固定，待测。

1.6指标检测方法

1.6.1TRPV1、3蛋白质检测采用免疫组织化学法(Immunohistochemistry)检测TRPV1、TRPV3蛋白质水平。石蜡组织包埋，以4 μm连续切片，采用免疫组化法检测。结果判读：镜下观察，背景呈蓝色，阳性呈棕黄色或棕褐色。由同一人员在统一设定条件下对所有标本进行测定。每张切片随机选取3个视野，由分析系统测定每一个视野中样本积分光密度(Integral Optical Density, IOD)，每个视野分析3次，每个指标取3个视野的平均值。

2　结果

2.1各组大鼠结肠组织病理学观察正常组与正常隔药灸组大鼠结肠黏膜完好，黏膜下及肌层组织形态结构正常，各层组织排列整齐。模型组大鼠黏膜、黏膜下及肌层组织形态结构紊乱，结肠黏膜上皮受损，黏膜下层有纤维细胞增生、充血水肿，有增生的肉芽组织，裂隙样溃疡，大量炎性细胞浸润。模型隔药灸组大鼠结肠见愈合性溃疡，轻度充血水肿，结肠黏膜下见少量纤维细胞增生，少量炎性细胞浸润，黏膜、黏膜下及肌层组织形态结构基本正常。提示模型大鼠肠道炎症明显，炎症性肠病模型制备成功；模型隔药灸组大鼠结肠炎症和纤维增生明显轻于模型组。

2.2TRPV1、3蛋白质检测结果隔药灸干预后，模型隔药灸组TRPV1蛋白的表达水平显著高于正常组、正常隔药灸组(均P<0.01)以及模型组(P<0.05)；模型组与模型隔药灸组TRPV3蛋白表达水平均显著高于正常组(P<0.05)。见表1。

表1各组大鼠TPRV1、3蛋白的表达

组别动物数TRPV1TRPV3A104666.9±993.11)3544.0±1791.1B105315.8±1692.12)5450.6±3178.83)C106676.0±1898.75671.3±1317.63)D104804.7±1166.31)4714.0±1029.5

注：与C组比较，1)P<0.01，2)P<0.05；与A组比较，3)P<0.05

3　讨论

艾灸是用易燃的艾绒在体表经穴或患病部位进行烧灼、熏烤，借助药物温热的刺激，直接或间接地施以适当温热刺激，通过经络的传导达到防病治病和养生的目的[12，13]。灸法在治疗炎症性肠病方面的效果已被大量临床和实验报道证实[14]。然而，灸法作用的起效机制仍不明确。

TRP是一种非电压依赖性阳离子通道，广泛表达于多种哺乳动物组织中，并参与多种重要的生理功能，包括肌肉收缩、递质释放、细胞增值、细胞分化、基因转录、细胞凋亡及细胞死亡等。现已发现8个TRP家族成员与温度感受相关，其中与温热刺激相关的主要是TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM4、TRPM5[1,14]。

温热刺激是艾灸发挥防病治病和养生作用的一个重要途径[15]。结合艾灸温度特点和TRPV家族的激活温度范围及分布特点，笔者认为TRPV家族在艾灸的作用机制中可能扮演着重要角色，尤其是TRPV1、TRPV2、TRPV3。热刺激(>43 ℃)可使TRPV1激活；TRPV2与TRPV1有50%的同源性，其被激活的阈值温度为52 ℃。TRPV3的激活温度范围为33℃～39℃，且反复热刺激后，TRPV3对热激活呈敏感化[1]。TRPV2的激活温度比TRPV1、TRPV3要高，虽然也是隔药灸所能达到的温度范围，然而艾灸温度从室温升高到极值需要一定时间，且为大鼠特制的艾炷燃烧时间有限。这从一定程度上影响了TRPV2的激活，从而也限制了TRPV2在艾灸过程中的作用。基于此，本实验选取TRPV1、TRPV3作为隔药灸作用基础的研究对象。

大量研究证明，TRPV家族成员在神经性炎症、内脏高敏感性疼痛、癌痛、呼吸道疾病的发生和发展中起到了重要的作用[16～25]。针对炎症性肠病的前期研究也表明了结肠中的TRPV1参与了炎症过程，并且与肥大细胞成正相关[26]。然而，作为重要的温觉感受器，TRPV除了介导伤害性刺激外，其存在是否有其他积极意义？本实验的结果显示，隔药灸干预后，模型隔药灸组TRPV1的蛋白表达水平显著高于正常组、正常隔药灸组以及模型组，模型组与模型隔药灸组TRPV3蛋白表达水平均显著高于正常组。这从一定程度上说明，TRPV1、TRPV3参与和介导了隔药灸的作用过程。

研究表明TRPV家族参与了机体的多种生理、病理过程[27～28]。对TRPV水平的调节能直接或间接地影响炎症、内脏痛、皮肤神经性炎症以及癌痛的治疗，因此TRPV家族已成为了医学者关注的对象。不同的艾灸方法所能产生的温度变化不尽相同，而温觉感受器的激活条件与介导的病理现象也各不相同，进一步研究TRPV各成员特点和影响因素，对选择正确的治疗方法有着重要的意义。本实验对TRPV的研究，提示我们可以从另一个角度来研究艾灸疗法，并为临床上如何选择合适的艾灸方法提供了新的参考。

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[28]Santoni G, Farfariello V, Amantini C. TRPV channels in tumor growth and progression[J]. Adv Exp Med Biol, 2011, 704: 947-967.

*基金项目：上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金(No.SZY10071)；国家自然科学基金青年科学基金项目(No.81202754)上海市卫生局青年科研项目(No.20134Y148)

doi:10.3969/j.issn.1003-8914.2016.02.029

文章编号：1003-8914(2016)-02-0214-04

收稿日期：(本文校对：齐丽珍2015-04-10)

Effect of Indirect Moxibustion on the Expression of TRPV in Rats with Inflammatory Bowel Disease

HONG Jue1WEI Kai2ZHANG Dan1ZHANG Linlin3LIU Jie1

(1.Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian, Shanghai 200030, China；2.Grade 2013 PHD Candidate, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China；3.Grdea 2013 Graduate, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China)

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of indirect moxibustion on the protein expressions of TRPV1, 3 in Tianshu (ST 25) acupoint area of rats with inflammatory bowel disease (IBD), and to explore the mechanism of indirect moxibustion in treating IBD. MethodMale SD rats of clean grade were used to develop IBD models. The rats were randomized into normal group (group A) and model group (group B), model indirect moxibustion group (group C) and normal indirect moxibustion group (group D). Group A and group B didn’t receive intervention. Group C and group D received indirect moxibustion at Tianshu (ST 25). At the end of the intervention, the protein expressions of TRPV1, 3 in Tianshu (ST 25) area were detected by using immunohistochemistry. ResultAfter indirect moxibustion, the protein expression of TRPV1 of group C was significantly higher than that of group A and group D (P<0.01) and group B (P<0.05), respectively. The protein expression of TRPV3 of group B and group C were significantly higher than that of group A (P<0.05). ConclusionRegulation of TRPV1, 3 in Tianshu (ST 25) area is possibly one of the mechanisms of indirect moxibustion in treating IBD.

Key words：Acupuncture-moxibustion therapy; Indirect moxibustion; Inflammatory bowel disease; TRPV