miR-221在甲状腺疾病中的表达及意义

冀　宏，底　旺，严　丽，张霖雷,李清怀

(河北医科大学第二医院甲状腺外科，河北 石家庄 050000)



miR-221在甲状腺疾病中的表达及意义

冀宏，底旺，严丽，张霖雷,李清怀*

(河北医科大学第二医院甲状腺外科，河北 石家庄 050000)

[摘要]目的探讨miR-221在甲状腺疾病穿刺细胞活检组织及外周血中的定量表达及意义。方法51例甲状腺结节患者采用超声引导下粗针穿刺细胞活检法获取标本，术前抽取外周血标本，采用定量 PCR 法检测组织及血浆中 miR-221的表达水平。结果miR-221在甲状腺良性结节组织中的表达与周围正常组织差异无统计学意义(P>0.05)，miR-221 在甲状腺癌组织中的表达明显高于穿刺病灶周围正常组织(P<0.05)；miR-221在不同甲状腺癌肿瘤病理分期及有无淋巴结转移方面表达差异有统计学意义(P<0.05)。甲状腺癌组外周血miR-221水平显著高于健康对照组和甲状腺良性病变组(P<0.05)。结论miR-221高表达与甲状腺癌的恶化过程关系密切，可为甲状腺癌术前诊断和个体化治疗提供新的思路。

[关键词]甲状腺肿瘤；聚合酶链反应；活组织检查，针吸

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.05.011

甲状腺癌是临床最常见的内分泌肿瘤，临床上对甲状腺癌的术前诊断最常依据彩超检查，并可进行超声引导下穿刺活检来协助诊断，细针穿刺细胞活检(fine needle aspiration biopsy，FNAB)具有较高的特异度和准确率，但由于一些客观因素如取材量不当等以及细胞结构特异性不够，往往导致部分患者不能明确诊断，而随着超声引导下粗针穿刺活检技术的不断进步，广泛开展后大大提高了诊断的准确率。戴维德等[1]报道微小 RNA(miRNA)是新近广泛研究的分子肿瘤标记物，已被证实与甲状腺癌的发生发展关系密切[2]。在miRNA家族中，miRNA因能反映恶性肿瘤的侵袭程度而受到广泛关注。在已发生侵袭的甲状腺癌组织中，有报道发现miR-221基因簇的表达显著高于未转移的FTC肿瘤组织，并与肿瘤患者的预后密切相关[3]。另有文献报道，miR-221在甲状腺癌中的高表达可作为良恶性肿瘤的鉴别方式[4]。但目前尚无关于将miR-221作为肿瘤标记物的相关报道。本研究应用RT-PCR技术探讨miR-221在不同甲状腺疾病患者术前穿刺活检组织及外周血中的定量表达情况。

1　资料与方法

1.1一般资料选择2013年5月—2015年8月河北医科大学第二医院收治的行甲状腺穿刺活检患者51例，男性13例，女性38 例；年龄 22～70 岁，平均( 45.8±23.6)岁，其中<45岁者25例，≥45岁者26例；手术切除后病理检查证实为甲状腺癌31例(乳头状癌25例，滤泡癌3例，髓样癌3例)，有淋巴结转移18例、无淋巴结转移13例，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期23例，Ⅲ+Ⅳ期8例；甲状腺良性病变20例，其中结节性甲状腺肿17例，桥本甲状腺炎2例，腺瘤1例。所有患者均无绝对手术禁忌症，手术前均未接受放疗、化疗及其他治疗，无其他脏器转移及合并疾病。另随机选择我院体检中心50例无肿瘤病变的健康志愿者用于血清学对照。健康对照组男性18例，女性32例，年龄22～68岁，平均(41.2±21.9)岁。2组一般资料差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

所有入组者均予以告知，所有患者均签署知情同意书，本研究经医院伦理委员会批准。

1.2方法所有患者术前均行超声引导下穿刺活检术，应用西门子公司Sequoia 512型彩色多普勒超声诊断仪，穿刺活检器材为美国巴德公司产BARDVIG1822型全自动活检枪，穿刺过程中采用18 GTru-cut活检针(弹射距离分15 mm和22 mm两档)。穿刺前患者凝血功能无明显异常，均停用抗凝药物7 d以上。穿刺时嘱患者平卧位充分暴露颈部，先行甲状腺常规超声选取最佳进针角度，常规消毒铺巾，2%的利多卡因局部麻醉，将18 G粗针在超声引导下到达肿块边缘，穿刺针道及针尖前方避开大血管及气管等重要器官，按压活检枪取得标本送检。

外周血标本采集：同期采集51例甲状腺疾病患者术前和50例健康对照组人群外周血标本，对比两者外周血miR-221表达量。

1.3RT-PCR检测提取全基因组mRNA，引物由上海生物工程有限公司设计合成。①逆转录过程： 将合成的cDNA加A反应在20 μL体系中进行，2 μL10X逆转录缓冲液，0.5 μL Poly(A)聚合酶3 mL miRNA混匀后37 ℃反应15 min，85 ℃反应5 s，反应的cDNA在-80 ℃低温冰箱内保存备用。②PCR过程：采用两步法反应程序，95 ℃变性5 min，40个PCR循环(95 ℃ 5 s、57 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s)；循环结束后60 ℃延伸10 min，每个标本均作复管 PCR 反应，至少重复 3 次。采用相对定量方法(2△△CT)对结果进行比较分析，计算2个复孔的平均值作为每个样本的实际CT值，同一样本的CT值减去其内参β-actin的CT值，获得△CT值，然后同一组的样本获得一个平均△CT值，在所有实验组的△CT值中选择一个最大△CT(Max)作为衡量的标准，用其他样本组的△CT值减去△CT(Max)值,最后根据待测基因和内参循环数CT值，按照公式相对值=2△△CT计算出待测样本待测基因相对于内参基因的相对表达量。

1.4统计学方法应用 SPSS 21.0 软件进行统计分析，计量资料比较分别采用F检验、q检验和t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1甲状腺疾病患者超声表现所有患者超声共表现72枚结节，直径0.5～2.7 cm，形态不规则者24例，边界不清者7例，周围有晕环者18例，内可见微钙化者21例，中央型血供者19例，有甲状腺囊肿者5例。超声引导下患者甲状腺穿刺活检均一次成功，切割不同层面长条状甲状腺瘤样组织，穿刺过程中无明显不适主诉，穿刺后仅1例患者因血供丰富而出现穿刺针道出血情况，压迫20 min后完全止血。穿刺完成后获得明确的病理结果，31例甲状腺癌穿刺活检病理与术后病理结果完全符合，诊断符合率100%。

2.2miR-221在不同甲状腺组织中的表达情况与病灶周围正常甲状腺组织相对比，miR-221在良性甲状腺结节病灶中表达量无明显升高(P>0.05)，而在甲状腺癌中的表达量则显著增加(P<0.05)，见表1。

2.3miR-221高表达与甲状腺癌临床病理特征间的关系miR-221表达水平在不同肿瘤病理分期和有无淋巴结转移甲状腺癌患者中差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.4miR-221在不同甲状腺疾病术前外周血中的表达甲状腺癌、甲状腺良性病变及健康对照组外周血miR-22相对表达量分别为0.96±0.22、0.35±0.13、0.16±0.11，甲状腺癌组外周血miR-221水平显著高于健康对照组和甲状腺良性病变组(F=258.074，P<0.05)。

表1miR-221在不同甲状腺组织中的表达比较

组别例数miR-221相对表达量甲状腺病灶周围正常组织510.23±0.07甲状腺良性结节200.31±0.05甲状腺癌300.89±0.16*# F413.578 P 0.000

*P<0.05与甲状腺病灶周围正常组织比较#P<0.05与甲状腺良性结节比较(q检验)

表2miR-221表达与甲状腺癌病理参数关系

参数 例数miR-221相对表达量tP年龄 <45 ≥4514170.86±0.030.88±0.061.185>0.05性别 男 女10210.86±0.020.85±0.031.099>0.05TNM分期 Ⅰ+Ⅱ Ⅲ+Ⅲ2380.81±0.031.02±0.078.227<0.05淋巴结转移 有 无18130.98±0.020.83±0.0315.685<0.05

3　讨　　论

甲状腺结节术前FNAB是临床上广泛应用并认可的诊断手段之一，有文献报道FNAB在甲状腺结节术前诊断的敏感度及特异度均高达90%以上[5]。虽然有学者将FNAB视为诊断甲状腺结节的首选手段[6]并将其列入甲状腺疾病诊治指南，但由于细针穿刺只能抽吸少量组织液进行细胞检测，标本量不足造成漏诊情况较多，会大大降低其诊断的敏感度和特异度，假阴性率较高，难以准确鉴别良、恶性疾病[7]。为了提高术前诊断准确率，临床上逐渐开展超声引导下粗针穿刺活检，凭借超声定位优势，在提高穿刺准确度的同时，降低了触诊活检的并发症[8]。相比于细针穿刺活检，粗针穿刺活检优点是非常明确的。本研究粗针活检结果与术后病理结果对比显示，对甲状腺癌的诊断符合率可达到100%，具有明显优势，此种方法不仅可以切割到长条状的甲状腺结节组织，还可以在超声导引下对不同层面的组织及被膜进行活检，这对后续的病理诊断及分型是非常有价值的[9]。而本研究5例甲状腺囊肿患者标本采集过程中在明确诊断的同时，给予囊肿液的抽吸并硬化治疗，使囊肿缩小，表明超声引导下的甲状腺粗针穿刺活检不仅诊断价值较高，还可以对良性病变实施有效的微创治疗，避免了此类良性病变实施手术切除的风险，降低了患者治疗费用。

甲状腺粗针穿刺活检在彩超引导下可避开病变周围大血管、神经及气管组织，并且可根据肿块大小及其周围毗邻情况选择不同的切割深度，从而避免损伤重要器官。本研究仅有1例出现针道出血，考虑其周围血供丰富而损伤小分支供血血管，经压迫后即可止血，表明粗针穿刺活检是相对安全可靠的检查方法。但此项技术的广泛开展需要独立的超声介入科配合，受限于穿刺操作人员的临床经验及甲状腺结节部位血供程度的不同，故在很多基层医院仍以FNAB为主。针对术前无法明确诊断的甲状腺结节患者，则需依赖术中冰冻病理检查或手术后病理检查来明确诊断，但这部分不能确诊患者术中或术后病理检查结果仅可使20%～25%的患者确诊为甲状腺癌，而其余大部分患者无需手术切除治疗。能否在甲状腺癌中探寻到一项高灵敏度和特异度的分子诊断标志物显得尤为重要，但目前的相关研究还停留在分子水平，缺少与临床病理资料的结合。

miRNA是一类由19～25个核苷酸组成的细胞内源性表达的非编码小分子RNA，广泛存在于脊椎动物中，具有高度保守性[10]。其表达及在肿瘤机制方面，已在肝癌、乳腺癌、胃癌等多种常见肿瘤中得到了深入研究，而在以甲状腺癌为代表的内分泌系统癌症中尚处于起步阶段[11]。本研究选择了miR-221这一在甲状腺癌及其他多种恶性人类肿瘤组织中均为高表达[12]的亚型进行临床病理相关研究。对甲状腺癌患者的全基因组miRNA表达谱进行分析时发现了一个异常的miRNA表达谱，其可以明确区分正常甲状腺组织与甲状腺癌组织，而在甲状腺癌组织中miR-221的表达相比正常甲状腺组织显著增加[13]。本研究结果显示，甲状腺癌患者血浆miR-221水平显著高于甲状腺良性结节及健康对照者(P<0.05)，同时甲状腺癌活检组织中miR-221 的表达水平明显高于甲状腺良性结节及病灶周围正常甲状腺组织。这与相关文献报道一致[14]。表明 miR-221 高表达可作为甲状腺癌的潜在标志物，可作为补充诊断方法。本研究结果还显示，miR-221 在TNMⅢ、Ⅳ患者的甲状腺癌组织中表达水平明显高于TNM Ⅰ、Ⅱ期的甲状腺癌组织，提示miR-221 在甲状腺癌发生及进展中可能发挥重要作用；同时，miR-221 在有无淋巴结转移的甲状腺癌组织中的表达量有明显差异，表明其在肿瘤的侵袭性方面有重要的意义。机制可能为 miR-221 通过抑制下游基因PTEN 及 TIMP3 的表达，最终使癌细胞容易发生浸润及转移[15]。

总之，与正常组织及甲状腺良性结节相比，miR-221在甲状腺癌组织中高表达，术前超声引导下粗针穿刺活检联合 miR-221检测可明显提高甲状腺结节的早期诊断准确率并为指导甲状腺癌的个性化治疗提供新的思路。

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(本文编辑：刘斯静)

[收稿日期]2016-01-25；[修回日期]2016-02-17

[作者简介]冀宏(1981-),女,河北枣强人，河北医科大学第二医院主治医师，医学硕士，从事甲状腺、乳腺外科疾病诊治研究。 *通讯作者。E-mail:aining1@163.com

[中图分类号]R736.1

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)05-0540-04

Expression and significance of miR-221 in patients with thyroid diseases

JI Hong, DI Wang, YAN Li, ZHANG Lin-lei, LI Qing-huai*

(Department of Thyroid Surgery, the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050017, China )

【Abstract】ObjectiveTo study the expression of miR-221 in biopsy tissue of thyroid disease and peripheral blood. MethodsSpecimens were obtained by ultrasound guided core-needle in 51 cases of patients diagnosed with thyroid nodules. Peripheral blood samples were collected before operation. Quantitative PCR method was used to detect the expression of miR-221 levels in tissue and plasma. ResultsThe difference of the expression of miR-221 in benign lesions and normal tissue was not statistically significant(P>0.05). In thyroid cancer cases, miR-221 expression level in cancerous tissue were significantly higher than that in normal tissue adjacent to thyroid leisions(P<0.05). There were significant differences in the expression of miR-221 in different pathological stages of thyroid carcinoma and in lymph node metastasis(P<0.05). The level of miR-221 in peripheral blood of patients with thyroid cancer was significantly higher than that in healthy control group and in benign thyroid disease group(P<0.05). ConclusionThe high expression of miR-221 is closely related to the progression of thyroid carcinoma., which can provide novel ideas with preoperative diagnosis and individualized treatment for thyroid cancer.

[Key words]thyroid neoplasms； polymerase chain reaction； biopsy, needle