D-半乳糖对SD大鼠记忆能力及海马区γ-氨基丁酸受体1和N-甲基-D-天冬氨酸2B受体表达的影响

路兰红，李秀清，刘媛媛， 隋月林*，刘建辉，路　宁

(1.沧州医学高等专科学校解剖教研室,河北 沧州 061001； 2.河北省沧州市人民医院病理科，河北 沧州 061001；3.河北医科大学临床医学专业2013级，河北 石家庄 050017)



D-半乳糖对SD大鼠记忆能力及海马区γ-氨基丁酸受体1和N-甲基-D-天冬氨酸2B受体表达的影响

路兰红1，李秀清2，刘媛媛1， 隋月林1*，刘建辉1，路宁3

(1.沧州医学高等专科学校解剖教研室,河北 沧州 061001； 2.河北省沧州市人民医院病理科，河北 沧州 061001；3.河北医科大学临床医学专业2013级，河北 石家庄 050017)

[摘要]目的观察注射D-半乳糖后大鼠学习记忆变化以及脑海马γ-氨基丁酸受体1(gamma-aminobutyric acid receptor 1，GABAR1)和N-甲基-D-天冬氨酸2B受体(N-methyl-D-aspartate receptor 2B，NMDAR2B)的表达变化，探讨衰老过程中认知水平下降与脑神经元可塑性变化的关系。方法将雄性SD大鼠随机分为对照组(10只)，实验组(20只)。实验组给予D-半乳糖溶液连续10周颈背部皮下注射(15 mg·kg-1·d-1)，对照组给予相同剂量的生理盐水，模型制作完成后进行Morris水迷宫实验，测试结束后采集大鼠脑组织，采用原位杂交和免疫组织化学技术，检测GABAR1及NMDAR2B基因转录以及蛋白表达的变化。结果实验组潜伏时间明显长于对照组，穿越目标次数明显少于对照组(P<0.05)。NMDAR2B和GABAR1以及NMDAR2B mRNA和GABAR1 mRNA各组大鼠均可见阳性表达。实验组NMDAR2B表达和mRNA转录均弱于对照组，而GABAR1表达和mRNA转录均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论在SD大鼠大脑衰老过程中，学习记忆下降与大脑海马区NMDA和GABA等神经递质受体表达的变化相关。

[关键词]半乳糖；记忆；衰老；大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.05.003

衰老是一个自发的必然过程，是机体自身结构和功能发生衰退、适应能力和抵抗力下降的过程[1]。作为生物体一种自然现象，衰老可导致组织器官发生退行性改变，出现机体功能下降和紊乱。衰老的机制包括氧自由基学说、DNA损伤修复学说、染色体突变学说、免疫学说等。近年来，衰老机制的研究得到了长足的进展，人们对抗衰老的机制也有了更深层次的认识，但至今仍未得到合理的解释，其中神经递质释放的改变是解释衰老的机制之一。本研究借助经典皮下注射D-半乳糖致衰老模型[2]，采用Morris水迷宫进行行为学测试，比较实验组和对照组大鼠的学习和记忆能力，观察大鼠认知下降与海马区γ-氨基丁酸受体1(gamma-aminobutyric acid receptor 1，GABAR1)和N-甲基-D-天冬氨酸2B受体(N-methyl-D-aspartate receptor 2B，NMDAR2B)表达的变化，探讨衰老过程中认知水平下降与脑神经元可塑性变化的关系，报告如下。

1　材料与方法

1.1实验动物无特定病原体级雄性SD大鼠30只(北京华阜康)经筛选无因视力及无法形成记忆的大鼠，3个月龄，体质量200～250 g。大鼠于实验前进行为期5 d的Morris水迷宫训练，随机分为对照组(10只)和实验组(20只)。

1.2实验材料D-半乳糖、兔抗鼠GABAR1抗体、NMDAR2B抗体、NMDAR2B/GABAR1原位杂交试剂盒、生物素化羊抗兔IgG、链霉亲和素-生物素复合物(strept avidin-biotin complex,SABC)和二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine,DAB)均购自Boster公司。

1.3实验方法

1.3.1模型制作、Morris水迷宫实验和标本制备实验组连续10周每日15 mg/kg颈背部皮下注射D-半乳糖溶液，对照组给予等量生理盐水注射。模型制作完成后，采用Morris水迷宫进行定位航行和空间探索实验。完成水迷宫测试1 h后，水合氯醛腹腔注射麻醉，开胸，暴露心脏，从心尖部插入灌注针至升主动脉，并剪开右心耳形成排出通道，快速灌入37 ℃生理盐水100～150 mL后，以4 ℃体积分数4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑，4%多聚甲醛后固定6 h，然后包埋、制成组织切片。

1.3.2免疫组织化学技术检测NMDAR2B和GABAR1的表达切片脱蜡至水，血清封闭，室温20 min，滴加兔抗鼠GABAR1抗体、NMDAR2B抗体，对照实验用羊血清替代一抗，4 ℃过夜，PBS冲洗3次；滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃孵育1 h，PBS漂洗5 min×3；滴加SABC，37 ℃，20 min，PBS漂洗5 min×3，DAB呈色。终止反应后干片，封片。光学显微镜观察，采用真色彩病理图像分析系统，定量表达结果采用阳性细胞平均光密度值。

1.3.3原位杂交技术检测NMDAR2B和GABAR1 mRNA的转录切片脱蜡至水，2%双氧水室温20 min，蒸馏水洗涤，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶，37 ℃消化60 min以暴露mRNA，20%甘油加入杂交盒保持湿度，加20 μL预杂交液42 ℃温箱2 h预杂交，滴加20 μL杂交液，42 ℃恒温过夜杂交，SSC缓冲液洗涤，滴加封闭液、生物素化鼠抗地高辛、SABC，DAB呈色。光学显微镜观察，采用真色彩病理图像分析系统，定量表达结果采用阳性细胞平均光密度值。

2　结　　果

2.1Morris水迷宫实验实验组定位航行实验潜伏时间明显长于对照组，而空间探索实验穿越目标次数明显少于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1，图1。

表12组逃避潜伏期及穿越目标次数比较

组别只数潜伏期时间(s)穿越目标次数(次)对照组108.85±2.2014.85±2.40实验组2015.08±2.3611.85±2.12t134.63320.912P0.0000.000

2.2免疫组织化学检测NMDAR-2B和GABAR-1表达的结果免疫组织化学结果和图像分析结果显示，2组均可见NMDAR2B和GABAR1阳性表达，细胞膜被染成黄色。实验组NMDAR2B表达弱于对照组，而GABAR1表达强于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2,图2。

表2　2组GABAR1及NMDAR2B表达比较

2.3原位杂交技术检测NMDAR2B和GABAR1 mRNA的转录结果原位杂交检测结果和图像分析结果显示，2组均有NMDAR2B mRNA和GABAR1 mRNA在转录，阳性结果呈黄色。实验组NMDAR2B mRNA表达弱于对照组，而GABAR1 mRNA表达强于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3，图3。

表3　2组GABAR-1及NMDA2B mRNA转录水平比较

3　讨　　论

3.1学习记忆与衰老研究衰老的动物模型较多，注射D-半乳糖是其中之一，具有耗时短、操作简便、可重复性强等优点。其机制为细胞内半乳糖浓度增加，可使半乳糖醇随之增加，后者可影响细胞渗透压，导致细胞肿胀和功能障碍等，最终发生衰老。目前认为，学习记忆的中枢主要在海马，学习和记忆的神经生理学基础是突触的可塑性改变。神经元可塑性的表现形式之一，是中枢兴奋性突触的长时程增强(long-term potentiation，LTP)。Morris水迷宫实验，是英国著名的心理学家Morris设计并应用于研究脑学习记忆机制的一种实验手段，是神经生物学研究动物空间学习、记忆功能常用的行为学检测方法，能够较准确地反映实验动物以视觉为基础的空间学习、记忆、定向及定位能力的变化。目前，Morris水迷宫实验在国内外已得到普遍认可，如顾平等[3]利用Moris水迷宫检测了帕金森大鼠空间学习记忆能力。赵冉冉等[4]测试了癫痫病大鼠的认知功能。定位航行实验主要考察空间学习能力，即记忆的获得巩固；空间探索实验的目的是测定观察对象的空间记忆能力，其存储信息的机制主要涉及海马、纹状体、基底前脑等边缘系统及大脑皮层相关脑区。潜伏期是检测大鼠空间学习记忆能力的重要指标[5]。本研究结果显示，实验组SD大鼠定位航行实验潜伏期明显长于对照组(P<0.05)，空间探索实验穿越目标次数明显少于对照组(P<0.05)。潜伏期延长，表明衰老可使空间定位模糊，学习功能减退；穿越目标次数减少，说明衰老也使空间记忆能力下降。与相关文献报道结果相近[6-7]。

3.2NMDAR2B与衰老NMDAR2B是谷氨酸受体亚型之一。谷氨酸是哺乳动物中枢神经系统内的主要神经递质，是兴奋性递质，约50%的谷氨酸参与调节中枢神经系统内的突触传递，几乎可调节正常脑内的所有功能，包括学习和记忆。谷氨酸受体可分为二大类，离子型受体和代谢型受体。离子型受体可再分为海人藻酸受体、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体和NMDAR。目前已有多种亚型被鉴定，NMDAR有6种亚型，NMDAR2B是一种分布在海马内的兴奋性神经递质受体。谷氨酸能激活海马C1区和齿状回的NMDAR，从而形成突触效应LTP。LTP与行为相关的记忆功能有关，LTP的减少可引起记忆的损伤，LTP的增加可促进学习和记忆能力[8-11]。使用一定强度和频率的电刺激，可使NMDAR2B去极化，产生一系列的生化反应，最终形成LTP，而LTP又可促进NMDAR2B的表达。LTP的产生与NMDAR2B电压依赖的Mg2+阻断特性有关。Miyashita等[12]研究发现在长时程记忆形成中Mg2+对NMDAR2B的阻断是必需的，Mg2+浓度的提高增加了GluN2B的表达量，GluN2B的增加能够增强NMDAR2B依赖的LTP[13]，提高学习记忆能力。LTP能够诱导NMDAR2B与CaMKⅡ形成更多的复合物，CaMKⅡ/NMDAR2B复合物被认为是一种记忆分子，对突触功能的维持有重要作用[14]。本研究实验组SD大鼠NMDAR2B及NMDAR2B mRNA的表达都弱于对照组，NMDAR2B及NMDAR2B mRNA表达下调，使LTP减弱，从而影响了学习和记忆功能。有文献报道，老年大鼠学习和记忆能力均显著下降(P<0.01)，海马神经可塑性蛋白表达明显降低(P<0.01)[15]。

本研究结果显示，在给予D-半乳糖皮下注射10周后，实验大鼠表现为认知功能下降趋势，Morris水迷宫实验显示大鼠的逃避潜伏时间明显延长，穿越目标次数明显减少；海马区兴奋性神经递质NMDAR2B表达和mRNA转录水平下调，而抑制性神经递质GABAR1表达和mRNA转录水平上调。提示在SD大鼠的大脑衰老过程中，其学习记忆下降与大脑海马区NMDA和GABA等神经递质的受体表达变化有关。但是，如何减轻衰老过程中神经细胞功能的减退，延缓衰老进程，预防老年痴呆症的发生，仍是亟待深入研究的一个课题。(本文图见封三)

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(本文编辑：许卓文)

[收稿日期]2016-01-12；[修回日期]2016-02-01

[作者简介]路兰红(1966-)，男，河北海兴人，沧州医学高等专科学校副教授，医学学士，从事人体解剖学基础教学和细胞生物学研究。 *通讯作者。E-mail：suiyuelin@sina.com

[中图分类号]R338.64

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2016)05-0506-05

Effects of D-galactose on cognitive quality and expression of GABAR1 and NMDAR2B in hippocampus in SD rats

LU Lan-hong1, LI Xiu-qing2, LIU Yuan-yuan1, SUI Yue-lin1*, LIU Jian-hui1, LU Ning3

(1.Department of Anatomy, Cangzhou Medical College, Cangzhou 061001, China; 2.Department of Pathology, people's Hospital of Cangzhou City, Hebei Province, Cangzhou 061001, China;3.Grade 2013 of Clinical Medicing, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

【Abstract】ObjectiveTo explor the effects of D-galactose on the cognitive quality decline and the neuronal plasticity in the process of aging by observing the changes of learning and memory quality and the expression of gamma-aminobutyric acid receptor 1(GABAR1) and N-methyl-D-aspartate receptor 2B(NMDAR2B) in rats. MethodsMale SD rats were randomly divided into experimental group(10) and control group(20). D-galactose (15 mg·kg-1·d-1) was subcutaneously injected for 10 weeks in experimental group and the same dose of physiological saline was given to control group. Morris water maze test was performed after model prepared. Then the brain tissue was collected and the mRNA transcription and protein expression of GABAR1 and NMDAR2B were detected by in situ hybridization and immunohistochemistry methods. ResultsThe latency was significantly longer and the frequency of passing through the target was significantly less in experimental group than those in the control group(P<0.05). GABAR1 and NMDAR2B were positively expressed at the mRNA and protein level in each group. The protein expression and mRNA transcription of NMDAR2B in experimental group were weaker than those in the control group. But the protein expression and mRNA transcription of GABAR1 were higher in experiment group than in control group，the difference was statistically significant(P<0.05). ConclusionThe learning and memory quality decline were related to the expression change of neurotransmitter receptors such as NMDAR2B and GABAR1 in hippocampus in the brain aging process of SD rats.

[Key words]galactose; memory; aging; rats