盐地碱蓬2个DREB1/CBF基因的克隆与表达调控分析

孙晓波，苏家乐，贾新平，梁丽建，肖　政，邓衍明

（江苏省农业科学院园艺研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，南京 210014）



盐地碱蓬2个DREB1/CBF基因的克隆与表达调控分析

孙晓波，苏家乐，贾新平，梁丽建，肖政，邓衍明

（江苏省农业科学院园艺研究所/江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，南京 210014）

摘要：【目的】从盐地碱蓬（Suaeda salsa L.）中克隆2个DREB1/CBF，分析其序列特征、编码蛋白的亚细胞定位和转录激活活性，以及在非生物胁迫下的表达模式，为进一步研究盐地碱蓬的抗逆机制提供依据。【方法】利用同源克隆法获得盐地碱蓬2个DREB1/CBF片段，采用RACE技术克隆获得cDNA全长序列，分别命名为SsCBF1 和SsCBF2。运用生物信息学软件对2个SsCBF及其编码蛋白进行分析，并将它们分别与GFP融合构建植物表达载体，通过基因枪转化法导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达，观察它们编码蛋白的亚细胞定位。利用酵母单杂交系统研究2个SsCBF与DRE/CRT顺式作用元件的结合特异性和转录激活活性。采用Real time-PCR研究2个SsCBF在低温、NaCl、PEG以及ABA处理下的表达模式。【结果】 SsCBF1编码一个225个氨基酸的蛋白，预测分子量为25.4 kD，理论等电点为4.84。SsCBF2编码一个由260个氨基酸组成的蛋白，预测分子量为28.6 kD，理论等电点为5.05。SsCBF1和SsCBF2均含有1个典型的AP2/ERF保守结构域，在核苷酸和氨基酸水平上分别具有53.5％ 和45.4％的同源性，而2个基因的AP2/ERF结构域在核苷酸和氨基酸水平上分别具有76.2％和 87.3％的相似性。SsCBF1、SsCBF2归属于DREB亚组的A-1组，定位于细胞核内，均能与DRE/CRT顺式作用元件特异性结合，并激活下游报告基因的表达。低温、干旱、高盐和ABA能够诱导SsCBF1表达，而SsCBF2在低温处理下表达量上调，但对干旱、高盐和ABA处理不响应。【结论】SsCBF1和SsCBF2是盐地碱蓬的2个胁迫应答转录因子。在盐地碱蓬中，SsCBF1通过依赖ABA途径参与对高盐、干旱和低温等非生物胁迫的应激调控，而SsCBF2则通过不依赖于ABA途径对低温胁迫产生响应。

关键词：盐地碱蓬；DREB1/CBF转录因子；亚细胞定位；酵母单杂交；荧光定量PCR

联系方式：孙晓波，E-mail：sunxiaobojaas@163.com。通信作者邓衍明，E-mail：nksdym@163.com

0 引言

【研究意义】盐地碱蓬（Suaeda salsa L.）为藜科碱蓬属真盐生植物，在中国分布广泛，可用于食品、饲料、医药等，是一种非常有价值的野生植物资源。盐地碱蓬不仅是典型的盐碱地指示植物［1］，还兼具耐旱［2］、耐涝［3］等特性，是研究植物抗逆机制理想的基因库［4］。但目前对它的研究主要集中于人工栽培［2，5］、生理生化［6-7］、营养组成成分分析［8-9］和组织培养［10-11］等方面，其抗逆机理及与抗逆相关基因还没有得到很好的挖掘和研究。DREB/CBF转录因子是目前研究最深入的抗逆相关转录因子，在植物对逆境胁迫的响应和耐性方面起关键作用［12-13］。克隆盐地碱蓬DREB/CBF，分析它们的序列特征、编码蛋白的亚细胞定位和转录激活活性，以及经高盐、干旱、低温和 ABA处理后的表达模式，对研究盐地碱蓬抗逆机制具有积极作用，为完善植物抗逆机理提供新的理论基础，同时也可为其他大宗农作物抗逆性状的遗传改良和种质创新提供新的基因资源。【前人研究进展】DREB/CBF转录因子是乙烯应答元件结合蛋白（AP2/EREBP）转录因子家族中的一个亚家族。在一些高盐、干旱和低温等胁迫应答基因启动子中，存在一至多个DRE/CRT顺式作用元件，DREB/CBF能与其特异性结合，激活下游抗逆功能基因的表达，从而增强植物对不良环境的抗性［14-15］。DREB/CBF家族蛋白可进一步分为A-1—A-6 6个亚组，其中A-1和A-2是2个最大的亚组，包括DREBl/CBF和DREB2两类基因，分别在冷胁迫及脱水和盐碱胁迫应答中起核心作用［14，16-17］。DREBl/CBF在植物中广泛存在，已陆续在拟南芥、油菜、大麦、水稻、番茄、黑麦草和大豆等多种甜土植物及一些盐生植物中被发现［18-25］。研究表明，DREB/CBF均含一个约由60个氨基酸残基组成的AP2/ERF保守结构域，包括YRG和RAYD 2个保守区。YRG为N端碱性亲水区，由19—22个氨基酸残基形成3个反向平行β折叠，有利于与DNA结合；其中第2个β折叠中的第14位缬氨酸（V）和第l9位谷氨酸（E）是决定DREB/CBF 与DRE/CRT特异性结合的关键位点［18， 26-27］。RAYD位于AP2/ERF的C端，含有一个由18个氨基酸形成的双亲 α螺旋酸性核心区域；其并不直接参与对DRE/CRT的特异识别，而是通过影响YRG的构象或通过与其他蛋白的相互作用来调节AP2/ERF与DNA的结合［26， 28］。不同DREBl/CBF蛋白的羧基端均存在一个“LWSY”保守序列，同时在AP2/ERF末端包含一个“DSAWR”保守序列，这两个保守序列是区分A-1组和其他 5个亚组 DREB蛋白的特征序列［15，17，19］。DREB1/CBF蛋白N-端一般含有1个保守的富含碱性氨基酸的核定位信号PKKR/PAGRxKFxETPHP；C-末端富含酸性氨基酸，被认为是转录激活区。【本研究切入点】目前，盐地碱蓬中与抗逆相关基因的研究主要集中在与渗透平衡、离子平衡和去除活性氧等相关的基因，关于盐地碱蓬DREB转录因子的报道还很少［29-32］，而有关DREB1/CBF参与盐地碱蓬非生物胁迫应答的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究采用同源克隆法获得2个DREB1/CBF cDNA片段，在此基础上，利用RACE技术分离克隆这两个基因的cDNA全长，同时对它们编码蛋白的特性、保守结构域、亚细胞定位、与DRE/CRT结合的特异性与转录激活活性及在不同逆境胁迫下的基因表达模式进行分析与检测，为探讨盐生植物盐地碱蓬的抗逆机制积累资料，同时也为通过基因工程改良植物抗逆性提供候选基因。

1 材料与方法

试验于2013年5月至2014年12月在江苏省农业科学院室内进行，田间样本采集分别在2013年4—9月和2014年4—9月在江苏省农业科学院滩涂试验地进行。

1.1 材料

试验所用材料为盐地碱蓬，取自江苏省农业科学院滩涂试验地。

将生长至10 cm（未有树生分枝）高的盐地碱蓬幼苗分 3部分处理，一部分幼苗提取肉质茎基因组DNA和总RNA，用于2个SsCBF的克隆；一部分幼苗被从培养土中取出，用无菌水冲洗干净，于 1/2 Hoagland营养液中过渡培养15 d，再分别转移至含有400 mmol·L-1NaCl、20 ％ PEG 6000和100 μmol·L-1ABA的1/2 Hoagland营养液中培养，并分别于0、0.5、2、4、8、12和24 h后剪去肉质茎以提取其总RNA，用于Real-time PCR分析；一部分幼苗移入光照培养箱进行 4℃低温处理，在处理 0、0.5、2、4、8、12 和24 h后取肉质茎并提取总RNA，用于Real-time PCR分析。

1.2 SsCBF1和SsCBF2片段的同源克隆

用植物基因组提取试剂盒提取盐地碱蓬基因组DNA。利用DNAMAN6.0软件比较NCBI数据库中已有植物DREB1/CBF的AP2/ERF结构域，从中选取2条保守氨基酸序列TRHPVYRGV和ACLNFADS设计1对简并引物，正向引物CBF-S：5′-ACG（A/T/C）A（C）GG（A/T/C）CAC（T）CCG（A/T/C）GTG（A/T/C）TAC（T）A（C）GG（A/T/C）GGG（A/T/C）GT-3′，反向引物CBF-AS：5′-GAA（G）TCG（A/T）GCA（G）AAA（G）TTG（A/T/C）AA（G）A（G）CAG（A/T/C）GC-3′。以盐地碱蓬基因组为模板，采用PCR聚合酶链式反应扩增AP2/ERF保守区同源序列。PCR反应体系为2.5 μL 10×PCR缓冲液、1.0 μL dNTP（脱氧核苷酸混合物，10 mmol·L-1）、正、反向引物10 μmol·L-1各1.0 μL、1.0 μL基因组DNA（浓度50 ng·μL-1）、0.25 μL LA-Taq酶和18.25 μL双蒸水。PCR反应条件为95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃1 min，35个循环；72℃ 10 min。PCR产物回收后与pMD18-T（TaKaRa）载体连接，转化，挑取白色菌斑，经 PCR筛选和酶切鉴定后送往上海生物工程公司进行测序鉴定。最终获得2条SsDREB1/CBF片段。

1.3 SsCBF1和SsCBF2的cDNA全长序列的获得

取经4℃低温处理的盐地碱蓬肉质茎，用SV Total RNA lysis试剂盒（Promega）提取总 RNA，并经DNaseⅠ消化去除DNA。通过测定其OD260/280比值和1％琼脂糖凝胶电泳比值，分析检测所提取总RNA的纯度、浓度及其完整性。以总 RNA为模板，采用Invitrogen公司5′/3′ RACE System（version2. 0）试剂盒克隆基因的末端序列。反转录引物使用3′AP（表1）。

为获得SsCBF1和SsCBF2的3′端序列，根据已获得的核苷酸序列，分别设计2条3′RACE特异性巢式引物 SsCBF1-3′GSP1、SsCBF1-3′GSP2和 SsCBF2-3′GSP1、SsCBF2-3′GSP2（表1），参照3′RACE试剂盒（Invitrogen）说明进行扩增，目标 PCR产物即为SsCBF1和SsCBF2的3′序列。设计2条5′RACE特异性巢式引物 SsCBF1-5′GSP1、SsCBF1-5′GSP2和SsCBF2-5′GSP1、SsCBF2-5′GSP2（表1），参照5′RACE试剂盒（Invitrogen）说明进行基因序列 5′RACE，目标PCR产物即为SsCBF1和SsCBF2的5′序列。确定目的片段的大小并用凝胶回收试剂盒对其进行回收，转化，挑取白色菌斑，经PCR筛选和酶切鉴定后送往上海生物工程公司进行测序鉴定。

使用DNAMAN软件将已知的中间序列与3′端和5′端序列进行拼接获得SsCBF1和SsCBF2的cDNA全长序列。在拼接的2条全长序列两端分别设计扩增全长所需引物 SsCBF1-S、SsCBF1-AS和 SsCBF2-S、SsCBF2-AS，以cDNA为模板进行PCR扩增，回收，连接，测序，与拼接序列进行比对，获得SsCBF1和SsCBF2的全长序列，并将2条序列提交到GenBank。

1.4 SsCBF1和SsCBF2的生物信息学分析

对盐地碱蓬SsCBF1和SsCBF2的碱基序列和所编码的氨基酸序列进行分析。通过 BLAST X和BLAST P搜索NCBI的核苷酸和蛋白质数据库，进行序列相似性分析及氨基酸保守性预测；ORF finder程序寻找开放阅读框；采用 ProtParam计算蛋白质的相对分子量和理论等电点；使用ClustaW1.83软件进行多重序列比对；利用 Mega5.1软件，采取 Neighbor-Joining法构建系统进化树；采用SignalP 4.0 Server预测蛋白的信号肽；利用TMHMM Server v.2.0软件对基因编码的氨基酸跨膜结构域进行预测和分析；ProtScale以默认算法（Hphob./Kyte & Doolittle）对蛋白进行亲疏水性预测；ExPaSy-SOPMA软件分析蛋白质的二级结构。

表1　RACE-PCR 扩增所用引物列表Table 1 List of primers used for RACE-PCR amplification

1.5 SsCBF1和SsCBF2的亚细胞定位

以SsCBF1和SsCBF2阳性克隆提取的质粒作为模板，分别以SsCBF1-OF1：5′-CCCAAATCCAATGG ATAATAATTATGGGCAGCAC-3′，SsCBF1-OF2：5′-TTACGCTGAGAAACTCCACAGTGA-3′和 SsCBF2-OF1：5′-CCCAAATCCAATGGACGTCTATTACAAC AACACC-3′，SsCBF2-OF2：5′-TCAAATGGAGTTGG AGTAACTCCA-3′作为引物扩增SsCBF1和 SsCBF2的编码区序列，将 PCR产物分别亚克隆至 pXDG-vector［33］GFP的下游，构建CaMV35S启动子驱动的携带有GFP和SsCBF1融合基因及GFP和SsCBF2融合基因的瞬时表达载体 pXDG-GFP-SsCBF1和pXDG-GFP-SsCBF2。切取2 cm×2 cm的洋葱内表皮组织置于固体平板MS培养基，28℃弱光下预培养 4—6 h后待用。采用 Bio-RAD公司 Model PDS-1000/He型基因枪进行轰击，每皿轰击1次，基因枪转化步骤参照参考文献［32］。将轰击后的洋葱内表皮细胞在MS培养基上25℃黑暗培养16—18 h后取出，在德国ZEISS LSM 510 META型激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光在细胞中的表达部位，利用计算机拍摄和存贮图像。以pXDG-vector载体作为阳性对照。

1.6 酵母单杂交

将人工合成的1条含有3个DRE/CRT核心序列的核酸序列及它的1条突变体核酸序列克隆到酵母的报告质粒pHIS2.1（Clontech公司），获得的DRE/CRT元件阳性质粒pHIS2. 1-DRE和mDRE元件阳性质粒pHIS2.1-mDRE［34］。根据SsCBF1和SsCBF2的编码序列分别设计1对引物，在正向和反向引物的两端分别引入XhoⅠ和SmaⅠ酶切位点，以SsCBF1和SsCBF2 的cDNA为模板进行PCR扩增。扩增产物经双酶切后与同样双酶切的酵母表达载体YepGAP（不带GAL4 AD 激活区）［27］连接，获得的阳性质粒分别命名为YepGAP- SsCBF1和YepGAP- SsCBF2。将构建好的2个表达载体分别与报告载体 pHIS2.1-DRE/pHIS2.1-mDRE共同转化酵母菌株Y187，在SD/-His-Ura-Trp平板上筛选转化子，获得的阳性克隆在 SD/-His-Ura-Trp+10 mmol·L-13-AT平板上进行检测。空 YepGAP载体作为阴性对照。

1.7 荧光定量PCR分析

根据SsCBF1和SsCBF2全长cDNA序列，选取不含保守序列的3′端核酸序列设计荧光定量PCR引物SsCBF1-qf：5′-CAGAATACATGGATGAGGAG-3′，SsCBF1-qr：5′-GAGACTTCATAGTCACTGTC-3′和SsCBF2-qf：5′-GCAGACAGTAGAAGTATCAG-3′，SsCBF2-qr：5′-CGATAGCAGTAGTAGTGGTG-3′。以盐地碱蓬Actin（GenBank登录号FJ587488）作内参，设计引物Ss-ActinF：5′-ACCGTTCCAATCTATGAGG -3′和 Ss-ActinR：5′-CGTAAGCCAACTTCTCCT-3′。利用罗氏Light Cycler 2.0型荧光定量PCR仪，参考SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，Japan）试剂盒说明书，采用三步法进行Real-time PCR：95℃ 30 s；95℃5 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，45个循环；60—95℃，每次上升0.5℃进行溶解曲线分析；72℃收集荧光信号。每个样品进行 3次重复，取其平均值。采用 2-ΔΔCt法进行数据的相对定量分析。

2 结果

2.1 盐地碱蓬SsCBF1和SsCBF2的克隆与结构分析

为获得盐地碱蓬DREB1/CBF AP2/ERF结构域的部分序列，采用DNAMAN6.0软件比较NCBI数据库中已有植物DREB1/CBF的AP2/ERF结构域，从中选取2条保守氨基酸序列TRHPVYRGV和ACLNFADS设计一对简并引物，以盐地碱蓬基因组为模板进行PCR扩增，获得1条约180 bp的PCR片段，经测序分析发现PCR产物中包含2种DREB1/CBF片段。根据这两个 DREB1/CBF片段测序结果设计 5′/3′RACE引物，分别经过两轮巢式PCR扩增，获得它们的cDNA全长，分别命名为SsCBF1（GenBank登录号为KM679415）和SsCBF2（GenBank 登录号为KM679416）。SsCBF1的cDNA全长1 105 bp，编码区长675 bp，编码225个氨基酸，蛋白分子量（MW）为25.4 kD，理论等电点（pI）为4.84；SsCBF2的cDNA全长952 bp，编码区长780 bp，编码260个氨基酸，蛋白分子量（MW）为28.6 kD，理论等电点（pI）为5.05。

搜索NCBI SMART网站进行蛋白质结构功能域分析，结果显示这两个蛋白均含有1个典型的由60个氨基酸组成的 AP2/ERF保守结构域。将这 2个AP2/ERF结构域提交到SWISS MODEL（http：// swissmodel.expasy.org）在线程序，以AtERF-1（PDB ID： 1gcc.1.C）分子模型为基础进行三维结构预测，结果显示这两个结构域均含有3个反向平行的β折叠和一个 α螺旋（图 1）。多序列比对结果显示，SsCBF1和SsCBF2序列差异较大，尤其是在N-末端和 C-末端，在核苷酸和氨基酸水平上分别具有53.5％和 45.4％的同源性；而 2个基因的 AP2/ERF结构域同源性很高，在核苷酸和氨基酸水平上分别具有76.2％和87.3％的相似性。SsCBF1和SsCBF2 在AP2/ERF结构域上游均含有1个保守的核定位信号“PKKRAGRKKFKETPHP”，而C-末端均富含酸性氨基酸（图2）。SsCBF1 AP2/ERF结构域第2个β折叠中第14位为缬氨酸，第19位为脯氨酸；AP2/ERF结构域下游含有序列“DSAWR”，羧基末端含有序列“LWSF”。SsCBF2 AP2/ERF结构域第2个β折叠中第14位和第19位分别为缬氨酸和谷氨酸；AP2/ERF结构域下游含有序列“DSSWR”，羧基末端含有序列“LWSY”（图2）。

图1　SsCBF1蛋白（a）和SsCBF2蛋白（b）的三级结构Fig. 1 Tertiary structures of SsCBF1 protein （a） and SsCBF2 protein （b）

2.2 盐地碱蓬SsCBF1、SsCBF2蛋白序列同源性和系统进化分析

利用 BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）将SsCBF1和SsCBF2蛋白序列与GenBank中的蛋白序列比对分析发现，它们与多种植物DREB的氨基酸序列具有同源性（图 2），SsCBF1与小叶杨PsCBF4（Populus simonii，AIU92947）、河北杨PhCBF4a、桃PpCBF1、蔷薇杂交栽培种Rh-DREB1B、马铃薯StCBF3、野生番茄ShCBF1和拟南芥AtCBF4的氨基酸序列一致性为48.7％—53％；SsCBF2与这些DREB氨基酸序列一致性为 42.2％—48.9％，低于SsCBF1与它们的同源性。

图2　SsCBF1、SsCBF2与其他7种植物A-1组DREB的氨基酸序列比对Fig. 2 Comparison of the deduced amino acid sequences of SsCBF1 and SsCBF2 with homologs from 7 other plants

以拟南芥145个AP2/ERF转录因子的分类为基础［18］，利用MEGA5.1软件对SsCBF1、SsCBF2和其他物种的DREB/CBF构建进化树（图3）。结果显示，SsCBF1和SsCBF2归属于 DREB亚组的A-1组，SsCBF1与桃的PpCBF1和杨树的PnDREB69亲缘关系最近，而 SsCBF2与马铃薯的 StCBF3和番茄的ShCBF1亲缘关系最近。

2.3 SsCBF1和SsCBF2的亚细胞定位

将构建好的2个GFP-SsCBF瞬时表达载体分别与金粉混合制备成混合液，经基因枪轰击转化洋葱表皮细胞后，于25℃黑暗培养16—18 h，使用激光共聚焦显微镜在488 nm波长下观察洋葱表皮细胞绿色荧光分布情况（图4）。在含空载体35S：：GFP的洋葱表皮细胞中，绿色荧光蛋白在细胞膜、细胞核及细胞质中均有表达（图4-A—图4-C）；而在表达GFP-SsCBF1融合蛋白（图4-D—图4-F）和GFP-SsCBF2融合蛋白（图4-G—图4-I）的洋葱表皮细胞中，绿色荧光仅在细胞核内被观察到，这一结果与用SignalP 4.0对它们信号肽的预测结果一致。

2.4 SsCFB1和SsCFB2在酵母中的功能验证

利用酵母单杂交系统检测SsCFB1和SsCFB2编码蛋白在酵母细胞内对DRE/CRT的结合特异性和转录激活活性。将构建好的 YepGAP-SsCBF1和 YepGAPSsCBF2载体分别和pHIS2.1-DRE/pHIS2.1-mDRE载体共同转化酵母菌株 Y187，在SD/-His-Ura-Trp平板上筛选转化子，将获得的阳性克隆进一步在SD/-His-Ura-Trp+10 mmol·L-13-AT平板上进行检测，观察它们生长状况（图5-A和图5-B）。结果表明，同时含有pHIS2.1-DRE和YepGAP-SsCBF1的酵母细胞能够在缺少组氨酸并加入10 mmol·L-13-AT的培养基上生长，而含有 pHIS2.1-mDRE和 YepGAPSsCBF1的酵母细胞不能在相应的筛选培养基上生长；同时含有pHIS2.1-DRE和YepGAP-SsCBF2的酵母细胞也能够在缺少组氨酸并加入10 mmol·L-13-AT的培养基上生长，而含有pHIS2.1-mDRE和YepGAPSsCBF2的酵母细胞不能在相应的筛选培养基上生长。作为阴性对照，同时含有pHIS2.1-DRE载体（或pHIS2.1-mDRE载体）和YepGAP空载体的酵母细胞在筛选培养基也都不能生长（图 5-B）。以上结果表明盐地碱蓬 SsCFB1和 SsCFB2编码的蛋白均具有DNA结合域和转录激活功能，能够与DRE/CRT元件特异性结合，并激活其下游基因的表达。

图3　SsCBF1、SsCBF2与已知DREB的系统进化树分析Fig. 3 Phylogenetic tree analysis of SsCBF1 and SsCBF2 with other plant DREBs

图4　GFP-SsCBF1和GFP-SsCBF2融合蛋白在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位Fig. 4 Subcellular localization of the GFP-SsCBF1 and GFP-SsCBF2 fusion proteins in onion skin cells

图5　SsCFB1和SsCFB2对DRE/CRT元件特异性结合能力及转录激活功能的检测Fig. 5 Analysis of DRE/CRT binding activity and transactivation ability of SsCFB1 and SsCFB2

2.5 SsCBF1和SsCBF2在盐地碱蓬中响应非生物胁迫的表达特性分析

通过 Real-time PCR对多种胁迫下 SsCBF1和SsCBF2在肉质茎中的表达丰度进行检测（图 6）。结果表明，SsCBF1的表达量在NaCl处理0.5 h迅速提高到对照的7.6倍，2 h后下降为对照的2.1倍，4 —24 h基本维持在对照水平的1.5—2倍，在48 h时恢复到未处理前水平；而SsCBF2的表达量在NaCl处理前后没有显著变化。SsCBF1在PEG处理下的表达模式与NaCl处理下的表达模式基本相似，表达量在处理0.5 h后剧烈升高到对照的68.4倍，2 h后下降为对照的22.8倍，4—12 h下降为对照的1.2—2.4倍，在处理48 h时表达量又逐渐升高到对照的6倍；而SsCBF2在PEG处理下维持组成型表达。低温处理能够诱导SsCBF1和SsCBF2的表达。SsCBF1的表达水平在低温处理2 h升高到对照的2.7倍，然后逐渐降低，在12 h又升高到对照的5.4倍，在48 h时下降到未处理前水平；SsCBF2的表达水平在低温处理下逐渐升高，在处理8 h达到最高，为对照的4.3倍，然后逐渐下降，48 h下降到对照的1.9倍。ABA处理能诱导SsCBF1的表达，在处理2 h时达到最高，为对照的4.5倍，在处理4—48 h时表达量逐渐下降，在48 h时为对照的57％；SsCBF2的表达水平在ABA处理前后没有明显变化。

图6　NaCl、PEG、4℃和ABA短期处理对SsCBF1和SsCBF2表达的影响Fig. 6 The expression analyses of SsCBF1 and SsCBF2 genes with the short-term treatments of NaCl， PEG， 4 ℃ and ABA

3 讨论

DREB/CBF转录因子是植物特有的转录因子，目前对其家族成员的研究主要集中在 DREB1/CBF和DREB2 2个亚组［14，16］。SsCBF1和SsCBF2是从盐地碱蓬中分离的2个DREB1/CBF同源基因，酵母单杂交试验表明，SsCBF1和SsCBF2编码的蛋白均能与DRE/ CRT元件特异性结合，尤其SsCBF1蛋白AP2/ERF结构域中第19位的脯氨酸并不影响其对DRE/CRT元件的特异性结合。在小麦、水稻、黑麦和大麦DREB1/CBF 的AP2/ERF结构域中也出现第19位的谷氨酸被脯氨酸取代的现象［14］。由此推测在 DREB1/CBF的 AP2/ ERF结构域中，第14位氨基酸在进化上的保守性比第19位氨基酸更强，可能对AP2/ERF与DRE/CRT的特异性结合起更重要的作用［35］。SsCBF1和SsCBF2 C末端分别含有酸性活化域“DDSDSDYE”和“DSFDDEIEAEDAD”，可能起转录激活功能［27，36］。

以前的研究显示只有低温能诱导DREB1/CBF的表达［27， 37-40］。然而，近年来的研究表明一些 DREB1/ CBF不仅能对低温胁迫作出响应，高盐、干旱及外源性脱落酸处理也能诱导它们的表达［41-44］。例如桉树的EguCBF1（包括EguCBF1a、EguCBF1b和EguCBF1d）只受冷胁迫的诱导，而EguCBF1c只对盐胁迫进行响应［45］。低温、干旱和高盐能诱导海榄雌AmCBF2的表达，而AmCBF1和AmCBF3的表达模式在这些环境刺激下没有明显的改变［46］。在本研究中，SsCBF1在盐、PEG和低温处理后表达量明显升高，表明SsCBF1可能作为几条逆境胁迫信号传导途径的交叉点或节点，参与盐地碱蓬对盐渍、干旱和低温胁迫的网络调控。SsCBF2在盐和PEG处理后表达量没有明显变化，而低温胁迫能显著诱导它的表达，表明SsCBF2可能仅参与盐地碱蓬对低温胁迫的网络调控，而不参与对盐渍和干旱胁迫的响应。

植物主要通过2条途径（依赖于ABA的调控途径和不依赖于ABA调控途径）调控胁迫响应基因的表达［15，47］。研究表明，无论是内源性或外源性的ABA，均参与响应于干旱、高盐和冷胁迫的基因调控途径［48-49］。本研究结果显示，外源ABA处理能诱导SsCBF1的表达，表明SsCBF1通过依赖于ABA的途径对低温、高盐和干旱胁迫产生响应。SsCBF2对外源ABA处理不响应，说明SsCBF2通过不依赖于ABA的途径对低温胁迫产生响应。SUN等［32］报道盐地碱蓬A-6组2个DREB基因通过不依赖于ABA的途径对对干旱和高盐胁迫作出响应。因此，可以推断盐地碱蓬DREB基因家族通过依赖于ABA和不依赖于ABA 2条调控途径对非生物胁迫产生响应。

4 结论

从盐地碱蓬中克隆了2个DREB1/CBF同源基因SsCBF1和SsCBF2，这两个基因编码的蛋白均含有1个典型的AP2/ERF保守结构域，归属于DREB家族的 A-1组。SsCBF1与桃的 PpCBF1和杨树的PnDREB69亲缘关系最近，而 SsCBF2与马铃薯的StCBF3和番茄的ShCBF1亲缘关系最近。SsCBF1和SsCBF2均定位于细胞核内，能与DRE/CRT元件特异性结合，并具有转录激活活性。在盐地碱蓬中，SsCBF1可能通过ABA信号途径参与对低温、干旱和高盐等非生物胁迫的应激调控，而SsCBF2则通过不依赖于ABA的途径对低温胁迫产生响应。

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（责任编辑 李莉）

Cloning and Expression Analysis of Two DREB1/CBF Genes in Suaeda salsa L.

SUN Xiao-bo， SU Jia-le， JIA Xin-ping， LIANG Li-jian， XIAO Zheng， DENG Yan-ming
（Institute of Horticulture， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement， Nanjing 210014）

Abstract：【Objective】 To provide basic information for understanding the resistant mechanism under abiotic stresses， two DREB1/CBF genes were cloned from Suaeda salsa L. At the same time， the sequence characteristics， subcellular localization and transcriptional activities of the two predicted DREB1/CBF proteins and their expression alteration in response to abiotic stress were analyzed. 【Method】The fragments of two DREB1/CBF genes were obtained by using the technique of homologous cloning. The full-length of cDNA sequences of the two DREB1/CBF genes were isolated by the method of rapid-amplification of cDNA ends （RACE）， and they were named as SsCBF1 and SsCBF2， respectively. The structures and functions of the two proteins encoded by SsCBFs were predicted by the bioinformatics software. In order to detect the subcellular localization of the two proteins， the coding sequences of the two SsCBF genes were fused， respectively， downstream to the GFP sequence to obtain two expression vectors and they were separately transferred into onion epidermal cells by the biolistic method. The binding specificity of SsCBF1 and SsCBF2to DRE/CRT cis-acting element and their transcriptional activities were investigated by using a yeast one-hybrid system. The expression of the two SsCBF genes in response to low temperature， NaCl，PEG and ABA were assessed by the real-time quantitative PCR.【Result】 SsCBF1 encoded a peptide of 225 amino acid residues with a predicted molecular mass of 25.4 kD and a pI of 4.84. SsCBF2 encoded a predicted protein of 260 amino acid residues with a predicted molecular mass of 28.6 kD and a calculated pI of 5.05. SsCBF1and SsCBF2 both contained a typical AP2/ ERF domain and shared 53.5％ and 45.4％ identity at the levels of coding nucleotides and amino acids. However， the AP2/ ERF domains of the two SsCBF genes were highly similar and shared 76.2％ and 87.3％ identity at the levels of nucleotides and amino acids， respectively. SsCBF1 and SsCBF2 were classified into A-1 subgroup of the DREB subfamily and both localized to the nucleus. The two proteins were able to specifically bind to the DRE/CRT sequence and activate the expression of the down-stream HIS reporter gene in yeast. Low temperature， drought， high salt and ABA could induce the expression of SsCBF1. However， the expression of SsCBF2 could only be induced significantly by low temperature， not by drought， high salt and ABA. 【Conclusion】 The SsCBF1 and SsCBF2 are two stress-responsive transcription factors of S. salsa. In S. salsa， SsCBF1 is involved in the stress responses of cold， high-salt and drought through ABA-dependent pathways and SsCBF2 is responsive to cold stress through ABA-independent pathway.

Key words：Suaeda salsa L.； DREB1/CBF transcription factors； subcellular localization； yeast one-hybrid； quantitative real-time PCR

收稿日期：2016-02-22；接受日期：2016-04-21

基金项目：国家“十二五”科技支撑计划（2013BAD01B070403）