猕猴桃细菌性溃疡病病原菌的荧光定量PCR检测方法优化

谢锦添+俞超+谭志文+吴月燕+马立孟

摘 要：该实验从引物浓度和退火温度2个方面对荧光定量PCR方法检测猕猴桃溃疡病病原菌方法进行了优化，并应用于染病样品的檢测。结果显示，10μM引物浓度、58℃退火温度为最适条件；优化后的方法能检测出猕猴桃溃疡病染病枝条，特异性较高，稳定性较好。优化后的荧光定量PCR方法可用于猕猴桃栽培中溃疡病菌的快速准确检验。

关键词：猕猴桃；溃疡病病原菌；荧光定量PCR；优化

中图分类号 S436.634.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）19-0018-3

Condition Optimization of Real-time PCR Detection Method of Kiwifruit Canker Pathogens

Xie Jintian et al

（College of Biological & Environmental Sciences，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China）

Abstract：In this experiment，real-time PCR detection method of kiwifruit canker pathogens was optimized from primer concentrations and annealing temperature，and applied to detect the infected samples. The result showed that primer concentration 10μM and annealing temperature 58℃ was most suitable. Symptomatic samples could be positively detected by optimized real-time PCR methods. Both specificity and stability of this method were high. The optimized real-time PCR method could be applied to detect canker pathogens rapidly and accurately in the kiwifruit cultivation.

Key words：Kiwifruit；Canker pathogen；Real-time PCR；Optimization

猕猴桃细菌性溃疡病是猕猴桃栽培过程中最具毁灭性的病害之一，制约了我国猕猴桃种植规模的扩大。该病的病原菌已被证实为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种Pseudomonas. Syringae pv. Actinidae（PSA）[1-4]，病原菌的快速、准确鉴定是有效防治溃疡病的主要措施，也是目前世界猕猴桃病害研究的热点。

国内外对于该病原菌的鉴定已建立了荧光定量PCR[5]、KN-PCR[6]、RG-PCR[7]、duplex-PCR[8]等分子检测方法，其中荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，Q-PCR）方法的灵敏度和特异性均显著高于其他方法，可以用于该病原菌早期样品的检测，但国内尚未有大量应用实例。为此，本研究将荧光定量PCR检测条件进行了优化，并应用于染病样品的检测，为开展浙江省猕猴桃溃疡病病原菌的准确鉴定、早期诊断提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 猕猴桃溃疡病菌PSA及相似菌丁香溃疡病菌（P. syringae pv. syringe，PSS）为本实验室分离保存。从浙江宁波、温州、绍兴、台州、杭州等地采集了染病枝条若干，并采集健康枝条作为对照。

1.2 方法

1.2.1 细菌基因组DNA和猕猴桃组织DNA的提取 细菌基因组DNA采用天根生化科技（北京）有限公司试剂盒提取，染病和健康猕猴桃枝条基因组DNA均采用天根公司生产的植物基因组DNA提取试剂盒提取，所提DNA样品用微量核酸分析仪检测纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小。检测后的DNA样品保存至-20℃备用。

1.2.2 荧光定量PCR检测条件优化 参考文献[5]合成引物P3F/P5R（5'-GGTTTCGGACACCGCAGGTTCTACCGAG

-3'，5'-CTTCCTGATCCCCGTTACCCATCGAC-3'）用于荧光定量PCR检测，引物合成由北京六和华大基因科技有限公司完成。将10ng PSA基因组DNA以10倍梯度稀释作为标准品，进行荧光定量PCR扩增。使用Bio-radi Cycler Q5 PCR仪进行荧光定量PCR。反应体系：引物各0.5μL，SYBR Premix Ex TaqTM 10μL，PSA基因组DNA 0.5μL，ddH2O 8.5μL，共20μL。设置3个引物浓度梯度5μM、10μM、100μM。每个浓度重复3次，取平均值。反应条件：预变性95℃ 3min；变性94℃ 10s，退火20s，延伸72°C每循环延伸后检测荧光，共40个循环；72°C延伸5min。每个反应设3次重复。55～95℃内，每升高0.5℃检测荧光信号。设置3个退火温度56°C、58°C、60°C。每个温度重复3次，取平均值。

1.2.3 猕猴桃枝条及病原菌的检测 浙江宁波、温州、绍兴、台州、杭州等地采集5份典型病症的猕猴桃枝条，1份健康猕猴桃枝条提取基因组DNA后，用本实验优化后的荧光定量PCR方法进行检测。同时，为分析本方法的特异性，猕猴桃溃疡病菌PSA和相似菌丁香溃疡病菌PSS的基因组DNA也加以检测。每个样品重复3次。

2 结果与分析endprint

2.1 细菌基因组DNA和猕猴桃组织DNA的提取 由图1和图2可知，猕猴桃枝条基因组DNA大小约15000bp，细菌基因组DNA條带大于2000bp，与预期相符；条带清晰无明显拖尾，可用于下一步荧光PCR的模板。

2.2 荧光定量PCR检测条件优化 表1显示，不同引物浓度会影响扩增效率，10μM的引物浓度下，扩增效率最高，达到102.6%，回归系数值为0.998，总体效果最佳。不同退火温度对扩增效率影响较明显（表2），退火温度为58℃时的扩增效率最高，达到105.9%，回归系数0.997，总体效果最佳。

2.3 猕猴桃枝条及病原菌的检测 图3显示，采用优化后的荧光定量PCR检测所采集的5份典型病症的猕猴桃枝条基因组DNA和溃疡病菌PSA基因组DNA，均有明显的溶解曲线单峰，且症状越明显峰顶越高；而作为阳性对照的猕猴桃健康枝条基因组DNA及相似菌丁香溃疡病菌PSS均未检出。实验结果验证了优化后的荧光定量PCR方法特异性高，较可靠，而且重复之间的Ct值变化不大，符合检测要求，表明该方法稳定性也较好。

3 结论与讨论

本实验从引物浓度和退火温度2个方面，对荧光定量PCR方法检测猕猴桃溃疡病菌PSA的条件进行了优化，并用优化后的方法检验所采集的猕猴桃枝条样品和病原菌样品。结果表明，优化后的方法能检测出猕猴桃溃疡病染病枝条和PSA病原菌，能够区别于健康枝条及PSS相似菌，特异性较高，稳定性较好。因此，优化的荧光定量PCR方法可用于猕猴桃栽培中溃疡病菌的快速准确检验，也为其他病原菌的检测提供了参考。

荧光定量PCR方法因其高灵敏度和特异性，越来越广泛地应用于植物病害的检测[9]，这项技术已成为一个近几年用于快速检测病原菌的研究热点。但是，这种技术也有其局限性，如试剂耗材费用较高，导致检验成本高；PCR反应体系对扩增效率的影响；灵敏度和重复性有待提高等。因此，其他基于PCR技术的检测方法仍在研究中，如最新发表的利用巢式PCR方法快速检测贮藏期猕猴桃果实表面溃疡病病原菌[10]等。猕猴桃溃疡病不仅应在宏观上加强预测预报的研究，而且应该加强对该病害的防治，贯彻“预防为主，综合防治”的植保方针[11]，利用农业、化学、生物等方法进行综合防治，以达到更好地控制效果。

参考文献

[1]Abelleiraa A，López M M，Pe?alver J，et al. First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syringae pv.actinidiae in Spain[J].Plant Disease，2011，95：1583-1583.

[2]Everett K R，Taylor R K，Romberg M K，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae causing kiwifruit bacterial canker in New Zealand[J].Australasian Plant Disease Notes，2011，6（1）：67-71.

[3]Vanneste J L，Pollakoff F，Audusseau C，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae，the causal agent of bacterial canker of kiwifruit in France[J].Plant Disease，2011，95：1311.

[4]赵利娜，胡家勇，叶振风，等.猕猴桃溃疡病病原菌的分子鉴定和致病力测定[J].华中农业大学学报，2012，31（5）：604-608.

[5]Gallelli A，Talocci S，Pilotti M，et al. Real-time and qualitative PCR for detecting Pseudomonas syringae pv. actinidiae isolates causing recent outbreaks of kiwifruit bacterial canker[J].Plant Pathology，2013，63（2）：264-276.

[6]Koh Y J，Nou I S. DNA marks for identification of Pseudomonas.Syringae pv. Actinidae[J].Molecules & Cells，2002，13（2）：309-314.

[7]Rees-George J，Vanneste J L，Cornish D A，et al. Detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae using polymerase chain reaction （PCR） primers based on the 16S-23S rDNA intertranscribed spacer region[J]. Plant Pathology，2010，59（3）：453-464.

[8]Gallelli A，L' Aurora A，Loreti S. Gene sequence analysis for the molecular detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae：developing diagnostic protocols[J].Journal of Plant Pathology，2011，93（2）：425-435.

[9]衡静，梁芳芳，于晓莹，等.实时荧光定量PCR技术及其在植物中的应用[J].河南农业，2013（16）：55-56.

[10]朱丹，曹凡，高贵田，等.贮藏期猕猴桃果实表面溃疡病病原菌的快速检测方法研究[J].核农学报，2017，31（3）：0493-0499.

[11]王丽，周增强，侯珲，等.我国猕猴桃细菌性溃疡病研究分析及防控[J]. 中国南方果树，2017，46（2）：178-182.

（责编：张宏民）endprint