瑞舒伐他汀通过抑制晚期糖基化终末产物受体改善晚期内皮祖细胞再内皮化功能*

钟钧琳，　张艳玲，　赵云跃，　刘金来△

(中山大学附属第三医院 1超声科， 2心内科，广东 广州 510630)

瑞舒伐他汀通过抑制晚期糖基化终末产物受体改善晚期内皮祖细胞再内皮化功能*

钟钧琳1，张艳玲1，赵云跃2，刘金来2△

(中山大学附属第三医院1超声科，2心内科，广东 广州 510630)

[摘要]目的： 研究C反应蛋白(CRP)对晚期内皮祖细胞的晚期糖基化终产物受体(RAGE)表达的影响，并探讨瑞舒伐他汀是否改善CRP诱导的晚期内皮祖细胞再内皮化功能。方法: Western blot检测RAGE蛋白表达情况，MTT检测细胞活力、Transwell小室检测迁移能力及黏附能力来观察瑞舒伐他汀对于CRP诱导的晚期内皮祖细胞再内皮化功能的影响。结果: 随着CRP刺激浓度增加，RAGE蛋白表达量逐渐增加；而瑞舒伐他汀预孵育后，RAGE表达量逐渐下降。瑞舒伐他汀对于CRP诱导后的晚期内皮祖细胞的细胞活性没有显著改变；而迁移能力和粘附能力均随着瑞舒伐他汀浓度逐渐增加而增加，其中10-6mol/L瑞舒伐他汀组与CRP对照组比较均显著增强(P<0.01)。结论: CRP上调晚期内皮祖细胞RAGE的表达，瑞舒伐他汀可通过抑制RAGE表达增强CRP诱导的晚期内皮祖细胞的迁移和粘附能力，从而改善其再内皮化功能。

[关键词]晚期内皮祖细胞； C反应蛋白； 晚期糖基化终末产物受体； 瑞舒伐他汀； 再内皮化

动脉粥样硬化可累及心、脑、肾、下肢动脉等全身多个部位，其病理基础主要是血管损伤后内皮功能不全及新生内膜过度增生，导致内皮损伤和修复间的动态紊乱[1]。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)作为一种能直接增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞，分为早期内皮祖细胞和晚期内皮祖细胞(endothelial outgrowth cells，EOCs)，其参与损伤后血管再内皮化和成体血管形成的功能可能成为改善动脉粥样硬化及动脉狭窄和防止经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)术后再狭窄的一个新方法[2]。研究发现[3],EOCs比早期EPCs有更强的黏附能力，在体外血管形成能力上，EOCs要显著强于早期EPCs。慢性血管内皮损伤性疾病，如吸烟、年龄、高脂血症、高同型半胱氨酸和C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)、高血压、糖尿病等危险因素下，其外周血中EPCs数量减少、功能减退。关于CRP对内皮细胞有致炎作用的报道已较多，我们之前的研究证实CRP对EOCs同样有致炎作用，但具体机制尚未明确[4]。既往研究发现在慢性炎症情况下，体内晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced end products，RAGE)表达会显著升高，其与配体结合后可激活细胞信号转导，促进基因表达及增加促炎症因子释放[5-6]，直接或间接参与动脉粥样硬化发生发展。本研究的目的是探讨RAGE是否介导CRP刺激后EOCs分泌炎症因子表达的增加，以及他汀药物对CRP诱导的EOCs再内皮化功能的影响。

材料和方法

1主要材料与试剂

重组人CRP购自Calbiochem；兔抗人RAGE多克隆抗体购自CST；兔抗人GAPDH单克隆抗体购自PeproTech；HRP偶联羊抗兔IgG II抗购自武汉博士德生物工程有限公司；蛋白定量试剂盒购自Bio-Rad；DAPI购自上海碧云天生物技术有限公司；MTT购自Sigma；Transwell小室购自Costar；瑞舒伐他汀购于南京德宝公司。

2方法

2.1人脐血EOCs的分离和培养及鉴定所有脐血均来自中山大学附属第三医院健康足月产孕妇脐带血，分离方法和培养条件参考文献进行[5, 7]，且经DiI-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色鉴定及流式细胞术分析EOCs的 CD34、KDR、CD133、CD14、CD45、CD31和CD105表达情况。

2.2瑞舒伐他汀细胞毒性实验以每孔4×103密度将等量EOCs种入96孔板，实验共分为6组：空白对照组；10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L和10-5mol/L瑞舒伐他汀组；DMSO(瑞舒伐他汀的溶剂，浓度为1∶1 000，与10-5mol/L瑞舒伐他汀组DMSO浓度相同)组。24 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育4 h。吸弃上清液后每孔加入150 μL DMSO，避光充分振荡15 min，上酶标仪检测波长490 nm处的吸光度。

2.3Western blot分析检测RAGE蛋白的表达按照以下情况分组：(1)CRP剂量依赖效应：0、10、25和50 mg/L CRP处理细胞；(2)瑞舒伐他汀对RAGE蛋白表达的影响：分别用不同浓度瑞舒伐他汀(0、10-8、 10-7、 10-6mol/L)预孵育12 h再加50 mg/L CRP刺激24 h，另设不加处理的空白对照组。按常规方法收集蛋白，上样50 μg，以110 V恒压转膜约90 min， I 抗为兔抗人RAGE多克隆抗体(1∶1 000)， II 抗为HRP偶联羊抗兔IgG(1∶2 000)，化学发光增强剂显影，以兔抗人GAPDH单克隆抗体(1∶20 000)为内参照进行灰度扫描并分析。

2.4内皮祖细胞活性的检测以每孔4×103密度将等量EOCs种入96孔板，24 h后用0、10-8、10-7和10-6mol/L瑞舒伐他汀孵育EOCs 12 h，再加50 mg/L CRP刺激24 h，另设不加处理的空白对照组。后每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，37 ℃孵育4 h。吸弃上清液后每孔加入150 μL DMSO，避光充分振荡15 min，酶标仪检测波长490 nm处的吸光度。

2.5内皮祖细胞迁移功能的检测予以0、10-8、10-7和10-6mol/L瑞舒伐他汀分别预孵育EOCs 12 h，后均再加50 mg/L CRP刺激EOCs 24 h，另设不加处理的空白对照组。分别消化、计数、调整细胞密度，以2×104个细胞(约300 μL细胞悬液)接种至Transwell小室上室，24孔板下室中加入含血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)50 μg/L的EBM-2培养基500 μL，孵育24 h。取出Transwell小室，4%多聚甲醛固定10 min，DAPI染核10 min。荧光显微镜下观察，每孔随机选取5个视野(×200)计数。

2.6内皮祖细胞黏附功能的检测予以0、10-8、10-7和10-6mol/L瑞舒伐他汀分别预孵育EOCs 12 h，后均再加50 mg/L CRP刺激EOCs 24 h，另设不加处理的空白对照组。各组贴壁细胞胰酶消化后重悬于EBM-2培养基，计数调整细胞密度，每组以相同数目细胞种入包被有人纤维连接蛋白24孔板中，37 ℃孵育1 h，随机取5个视野(×100)中的贴壁细胞计数。

3统计学处理

每组实验重复3次以上，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示, 所有统计学处理均采用SPSS 17.0统计软件进行分析。主要统计数据均进行正态性及方差齐性检验，正态分布数据组间差异性比较采用单因素方差分析，Bonferroni法进行多重比较。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1EOCs鉴定

荧光显微镜观察，DiI-ac-LDL和FITC-UEA-I双染色阳性的细胞为正在分化的EOCs；用流式细胞术检测，可见干细胞标志性抗体CD34阳性而CD133阴性，内皮细胞系标志性抗体KDR、CD31和CD105阳性，而单核巨噬细胞系标志性抗体CD14和CD45阴性。

2CRP诱导EOCs RAGE蛋白的表达

Western blot结果显示随着CRP刺激浓度(10、25和50 mg/L)增加，RAGE蛋白表达量逐渐增加(P<0.01)，见图1。

Figure 1.The effects of CRP on the protein expression of RAGE in EOCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 mg/L.

图1CRP对EOCs RAGE蛋白表达的影响

3瑞舒伐他汀的细胞毒性实验

10-8、10-7和10-6mol/L瑞舒伐他汀处理EOCs后，其增殖活性与空白组比较均未见明显变化，而10-5mol/L瑞舒伐他汀处理EOCs则使其增殖活性明显下降，与空白组比较具有显著差异(P<0.05)；另一方面，配制瑞舒伐他汀的溶剂DMSO对于细胞的增殖活性没有影响，而10-5mol/L瑞舒伐他汀浓度过高，对细胞有毒性作用，见图2。故以下各个实验中瑞舒伐他汀选取10-8、10-7和10-6mol/L 3个剂量干预细胞。

Figure 2.The cytotoxic effect of rosuvastatinin (Rosuv) on EOCs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol.

图2不同浓度瑞舒伐他汀对EOCs的毒性作用

4瑞舒伐他汀下调CRP诱导的EOCs RAGE蛋白的表达

与正常对照组比较，CRP组细胞内RAGE表达量升高(P<0.05)。而随着瑞舒伐他汀浓度增加，各组RAGE表达量则逐渐下降，与CRP组比较差异有统计学意义(P<0.01)，见图3。

Figure 3.The effects of rosuvastatin (Rosuv) on the protein expression of RAGE in EOCs after CRP stimulation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCRP;#P<0.05vscontrol.

图3瑞舒伐他汀对CRP诱导EOCs RAGE蛋白表达的影响

5EOCs的体外功能实验

5.1细胞活力予以10-8、10-7和10-6mol/L瑞舒伐他汀分别单独孵育或与CRP共同孵育EOCs，均不影响其细胞活力，见图4。

5.2迁移功能CRP刺激后EOCs迁移能力减退，而瑞舒伐他汀能改善CRP诱导后EOCs迁移能力，随着他汀浓度增加，CRP刺激后的EOCs迁移能力逐渐增强，其中10-7mol/L和10-6mol/L组与CRP对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.01)，见图5。

Figure 4.The effects of rosuvastatin (Rosuv) on the proliferation of EOCs after CRP stimulation. Mean±SD.n=3.

图4不同浓度瑞舒伐他汀对CRP诱导的EOCs细胞活性的影响

Figure 5.The effects of rosuvastatinin (Rosuv) on the migration of EOCs after CRP stimulation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCRP;##P<0.01vscontrol.

图5不同浓度瑞舒伐他汀对CRP诱导的EOCs迁移能力的影响

5.3黏附功能倒置显微镜计数可见CRP刺激后EOCs贴壁数量较空白组明显减少，而瑞舒伐他汀能增加CRP诱导后EOCs贴壁细胞的数量，随着他汀浓度增加，EOCs贴壁数目逐渐增多，其中10-6mol/L与CRP组比较，差异有统计学意义(P<0.01)，见图6。这表明瑞舒伐他汀能改善CRP诱导后EOCs的黏附能力。

讨论

从大量既往研究可知，在健康成年人体内CRP分泌的基础水平是独立于其它危险因素、能提示心血管疾病的危险因素[8-9]。有研究表明CRP能刺激单核/巨噬细胞、内皮细胞、平滑肌细胞分泌一系列促炎因子[10]；我们之前的研究也证实CRP能刺激EOCs分泌单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、白细胞介素8(interleukin-8, IL-8)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)及细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1)[4]，表明CRP对EOCs亦具有致炎作用。本研究证明CRP能上调EOCs 的RAGE表达。RAGE在固有免疫应答过程中发挥重要作用[11]，配体与RAGE结合后激活细胞内一系列信号转导通路[12]，包括启动促炎因子分泌的转录因子NF-κB途径、促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)通路及PI3K/Akt通路，故可推测CRP通过上调RAGE刺激EOCs分泌IL-8、MCP-1、VCAM-1及ICAM-1，导致EOCs对受损内皮的归巢、黏附能力下降，再内皮化功能受损。

Figure 6.The effects of rosuvastatin(Rosuv)on the adhesion of EOCs after CRP stimulation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCRP;##P<0.01vscontrol.

图6不同浓度瑞舒伐他汀对CRP诱导的EOCs黏附能力的影响

他汀类作为一种羟甲基戊二酰辅酶A(hydroxy-methyl-glutaryl coenzyme A，HMG-CoA)还原酶抑制剂，许多大型随机对照试验已证明不论一级还是二级预防他汀类都能明显降低心血管危险因素，而这些作用独立于降血脂效应，其中包括改善内皮细胞功能[13]、增加纤维蛋白溶解抗血栓[14]、抗炎作用等。Mahajan等[15]报道，CRP通过细胞CD32受体激活MAPK(ERK、p38和JNK)通路，从而促进人白血病单核细胞RAGE和其配体EN-RAGE表达增加，参与炎症反应、动脉粥样硬化过程，而阿托伐他汀能降低CRP诱导的RAGE表达，抑制炎症反应过程发生发展。我们也证明了瑞舒伐他汀能抑制EOCs RAGE表达，从而改善CRP诱导的EOCs炎症因子分泌情况。正如Szmitko等[16]所述，内皮祖细胞能否归巢、整合到缺血组织或受损血管处主要取决于其数量多少和细胞黏附性，本研究进一步证明了瑞舒伐他汀能改善CRP所致的EOCs迁移功能及黏附功能减退，故达到了改善EOCs再内皮化的功能。但本研究证明10-8、10-7和10-6mol/L的瑞舒伐他汀均对EOCs的活力没有显著影响，且对CRP刺激后的EOCs活力也没有显著影响，这与Chen等[17]研究报道的AGEs对EOCs活力的影响结果一致；而他汀类药物能改善成熟内皮细胞的增殖活性，可能与EOCs增殖能力较成熟内皮细胞强有关。10-5mol/L的瑞舒伐他汀会降低EOCs的活力，这与Weis等[18]证实的高浓度他汀导致内皮细胞凋亡、抑制成血管功能的结论相一致。

综上所述，我们首次在EOCs探讨CRP对RAGE的影响，说明RAGE可能为CRP影响其功能的一个新靶点，且首次观察到瑞舒伐他汀能抑制CRP诱导的RAGE表达，减少CRP导致的炎症因子分泌增加，且改善了EOCs迁移和黏附能力，最终促进了EOCs再内皮化功能，可能对动脉粥样硬化防治提供新的途径。但有关RAGE下游信号分子的表达情况有待进一步研究。

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(责任编辑： 卢萍， 罗森)

Rosuvastatin enhances reendothelialization of endothelial outgrowth cells induced by C-reactive protein through regulating receptor for advanced glycation end products

ZHONG Jun-lin1, ZHANG Yan-ling1, ZHAO Yun-yue2, LIU Jin-lai2

(1DepartmentofUltrasound，2DepartmentofCardiology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:lj.lai@medmail.com.cn)

[ABSTRACT]AIM: To observe the effect of C-reactive protein (CRP) on the receptor for advanced glycation end products (RAGE) expression in human endothelial outgrowth cells (EOCs), and to investigate the improving effect of rosuvastatin on the reendothelialization of EOCs induced by CRP. METHODS: EOCs were treated with CRP at different concentrations, or pre-incubated with rosuvastatin at different concentrations and then stimulated with CRP. The protein expression of RAGE was detected by Western blot. MTT assay was used to determine the viability of EOCs, and Transwell assay was used to detect the cell migration and adhesion. RESULTS: The protein expression of RAGE increased after CRP stimulation in a dose-dependent manner, and significantly decreased by pre-incubated with rosuvastatin at different doses. After treatment with different doses of rosuvastatin, the in vitro functions (migration and adhesion) of CRP-induced EOCs were dose-dependently upregulated. However, no change of the cell viability was observed. CONCLUSION: CRP increases the expression of RAGE. Rosuvastatin may improve CRP-induced reendothelialization (migration and adhesion) of EOCs by inhibiting RAGE expression.

[KEY WORDS]Endothelial outgrowth cells; C-reactive protein; Receptor for advanced glycation end products; Rosuvastatin; Reendothelialization

[文章编号]1000- 4718(2016)01- 0015- 06

[收稿日期]2015- 07- 08[修回日期] 2015- 11- 02

*[基金项目]广东省自然科学基金资助项目(No. 07001556)

通讯作者△Tel： 020-85252168； E-mail： lj.lai@medmail.com.cn

[中图分类号]R363

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.003