小鼠脑缺血时自噬相关基因5的抗损伤作用*

彭志锋，　王喜英，　杨靖辉

(山西大同大学医学院 1生理教研室， 2微生物与免疫学研究所，山西 大同 037009)

小鼠脑缺血时自噬相关基因5的抗损伤作用*

彭志锋1△，王喜英2，杨靖辉1

(山西大同大学医学院1生理教研室，2微生物与免疫学研究所，山西 大同 037009)

[摘要]目的： 观察自噬相关基因5(Atg5)在小鼠脑缺血再灌注损伤中的抗损伤作用。方法：将雄性BALB/c小鼠随机分为假手术(sham)组、缺血再灌注(I/R)组、Atg5 siRNA组和control siRNA组。I/R组采用大脑中动脉阻塞(MCAO)60 min后再灌注24 h。Atg5 siRNA组和control siRNA组将5 μL Atg5 siRNA或scrambled siRNA在MCAO前24 h侧脑室注射。实时荧光定量PCR和Western blot检测Atg5的表达；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法检测抑制Atg5对缺血再灌注损伤后脑梗死面积和水肿率的影响；神经行为学评分法检测抑制Atg5对缺血再灌注损伤后神经症状的影响。结果：MCAO后再灌24 h，缺血半影区Atg5 mRNA和蛋白水平显著增高(P<0.05)；Atg5 siRNA明显降低缺血再灌后Atg5 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)；侧脑室给予Atg5 siRNA能显著增加脑梗死面积和水肿率，并加重神经行为学损伤(P<0.05)。结论：沉默Atg5加重小鼠脑缺血再灌损伤，提示MCAO后诱导的 Atg5 可减轻小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤。

[关键词]自噬相关基因5； 自噬； 缺血再灌注损伤

缺血性脑血管疾病因其发病急，而且致残致死率高，已经成为危害人类健康的一类重大疾病[1]。在缺血性脑血管病治疗过程中不可避免会出现再灌注损伤。然而，临床上仍然缺乏有效的治疗再灌注损伤的药物和措施。

自噬是通过自噬溶酶体系统对自身细胞质内异物、损伤和衰老细胞器进行吞噬降解的过程，它可以使蛋白等能量物质循环再利用，对细胞生长、器官正常发育具有重要的作用[2]。大量的研究显示，在哺乳动物脑缺血模型中，包括缺氧-缺血和局灶或全脑缺血模型，都可诱发神经元自噬[3-4]。自噬相关基因5(autophagy-related gene 5，Atg5)是参与自噬调控的重要基因，位于人类染色体6q21，编码276个氨基酸[5]。Atg5定位于自噬体膜的表面，促进了自噬体膜的伸展扩张，诱导自噬体形成，是自噬体形成所须的重要因素。研究发现，敲除Atg5可导致小鼠自噬功能不全而于出生后数小时内死亡[6]。最近我们的研究证实下调miR-181b减轻小鼠脑缺血性损伤，具有神经保护作用，可能是通过上调其靶基因Atg5发挥作用的[7]。然而Atg5在小鼠再灌注损伤中的作用未见相关报道。因而，本研究借助大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)致小鼠脑缺血模型，探讨Atg5在小鼠再灌性损伤中的作用。

材料和方法

1动物和分组

健康成年(12～14周)、雄性BALB/c小鼠，体重18～22 g，购自首都医科大学动物部，许可证号为SCXK-(军)2007-004。将雄性BALB/c小鼠随机分为4组：假手术(sham)组、缺血再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)组、Atg5 siRNA组和control siRNA组。

2仪器和试剂

小鼠脑立体定位仪(北京沙东生物有限公司)；Mx3000PTM实时荧光定量PCR仪(Agilent)；Atg5 si-RNA和control siRNA(Ribobio)；兔抗Atg5多克隆抗体、鼠抗β-actin多克隆抗体(Sigma)；荧光定量PCR试剂盒(上海敏科生物科技有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)购自Sigma；基因特异性引物由上海生工合成。

3主要方法

3.1MCAO诱导局部脑缺血再灌模型制备腹腔注射1%戊巴比妥钠(0.06 g/kg)麻醉小鼠，自颈部行1 cm长的正中纵切口，钝性分离下颌下腺，暴露胸锁乳突肌。手术显微镜下暴露左侧颈动脉鞘并游离出颈总动脉、颈外动脉及颈内动脉，然后用5/0缝合丝线双重结扎颈总动脉近心端和颈外动脉远心端；在颈总动脉上两线结间打一松结并轻轻提起以阻断血流，在颈外动脉远端的动脉壁上用针头扎一个小口，将制备好的线栓(头端直径0.23 mm、主干直径0.18 mm)从小孔插入颈总动脉至颈内动脉并进而向上到达大脑中动脉(直至遇到轻微阻力，深度约12.0 mm)，固定线栓，将下颌下腺归位，60 min 后拔出线栓，缝合皮肤。模型成功的标志是小鼠麻醉清醒后出现手术侧肢体瘫痪，站立不稳，小鼠可存活1周。MCAO手术成功率约为70%。Sham组只进行手术操作，不插入线栓。整个手术过程平均20 min完成，此间保持小鼠体温，术后放入有清洁垫料的饲养盒中，自由饮水、进食。

3.2侧脑室给药小鼠在MCAO手术前先经1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后固定于小鼠脑立体定位仪上，局部用利多卡因局麻后行正中切口，按Munoz侧脑室注射方法[8]，以前囟为零点，在前囟后0.5 mm，左侧1.0 mm和3.5 mm深度将5 μL的Atg5 siRNA(2 g/L)或scramble siRNA分别5 min内注入小鼠左侧脑室，注射完毕静待5 min后轻轻地拔出微量注射器，注射结束后缝合头部皮肤24 h再进行MCAO模型制备。

3.3Western blot分析提取大脑缺血半影区[9]总蛋白，取30 μg进行SDS-PAGE，然后转至PVDF膜上。经5%牛奶孵育1 h后，并用磷酸盐缓冲液(PBS-T)洗膜3次，每次10 min。用兔抗Atg5多克隆抗体(1∶1 000)和鼠抗β-actin多克隆抗体(1∶2 000) 4 ℃孵育3 h，PBS-T洗3次，每次10 min。用PBS-T稀释山羊抗兔和山羊抗鼠的 II 抗(1∶25 000)，室温孵育1 h。PBS-T洗3次，每次5 min。洗膜后用化学发光扫描系统检测并摄片，以β-actin为内参照，应用图像分析软件Quantity One进行吸光度积分值分析。

3.4实时荧光定量PCR首先用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit提取大脑缺血半影区总RNA，应用miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR进行反转录反应，再用特异性引物进行实时荧光定量PCR扩增。引物序列如下：Atg5的上游引物序列为5’-TGGCCTACTGTTCGATCTTCT-3’， 下游引物序列为5’-ACAGTGCAGAAGGTCCTTTTC-3’；beclin-1的上游引物序列为5’-CTGATGGTGGCACCATGGA-3’， 下游引物序列为5’-GCCAGACATGATGTCAAAAAG-3’。通过分析软件得到每组的Ct值，其中U6 RNA作为内参照；参照文献报道的方法，按下述公式进行比较不同处理后基因相对表达的计算：相对基因表达=2-(ΔCt sample-ΔCt control)[10]。

3.5神经行为学评价 MCAO后再灌24 h，根据文献报道方法[11]进行神经行为学评分，观察性评价指标包括运动减少、姿势侧倾、拖地步态、共济失调等；操作性评分指标包括低反应性、前肢屈曲、肌肉强度降低、身体旋转和运动失调等。分值越高，代表损伤越严重。

3.6TTC染色神经行为学评分后，将小鼠迅速断头取脑，-20 ℃冷冻约15 min后行厚1.5 mm的冠状切片，将脑片迅速置于1%的TTC磷酸盐缓冲液中，37 ℃避光孵育约10 min，正常脑组织染为深红色，脑梗死区不着色(灰白色)。根据文献报道计算脑梗死体积以及水肿率[12]。

4统计学处理

实验数据用SPSS 17.0统计软件分析，结果以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，两组间比较采用Bonferroni校正的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1小鼠脑缺血再灌注损伤后自噬调节基因表达的变化

与sham组相比，I/R组的Atg5和beclin-1 mRNA表达显著增高(P<0.05)。Atg5 siRNA组小鼠Atg5 mRNA表达明显降低(P<0.05)，而beclin-1 mRNA的表达无明显变化，见图1。

Figure 1.The mRNA expression of Atg5 and beclin-1 in defferent groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

图1不同组间Atg5和beclin-1的mRNA表达情况

2小鼠脑缺血再灌注损伤后Atg5蛋白水平表达的变化

与sham组相比，I/R组Atg5表达显著增高(P<0.05)；MCAO手术前侧脑室注射Atg5 siRNA后， Atg5蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；control siRNA组Atg5蛋白表达与sham组相比差异无统计学意义，见图2。

Figure 2.The protein expression of Atg5 in defferent groups. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssham;#P<0.05vsI/R.

图2不同组间Atg5蛋白的表达情况

3Atg5 siRNA对MCAO后小鼠神经行为损伤的影响

缺血再灌24 h后对小鼠的神经行为表现进行观察，发现sham组小鼠神经行为学表现基本正常，神经行为学评分为2.1±0.9。缺血再灌性损伤使小鼠的神经行为学功能受到严重损伤，具体表现为活动减少、侧倾、转圈、低反应性、前肢屈曲和运动失调等，神经行为学评分上升为8.5±0.2(P<0.05)。MCAO手术前侧脑室注射Atg5 siRNA使行为学损伤进一步加重，行为学评分上升至11.5±0.3，与I/R组相比差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　各组神经行为学评分

The percentage indicated the proportion of the positive behaviors showed up in different groups.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsI/R group.

4Atg5 siRNA对MCAO后小鼠脑梗死体积和水肿率的影响

TTC染色发现，sham组全脑切片染色为均匀红色，无缺血灶。I/R组有明显的小鼠局灶性脑缺血[(36.3±0.9)%]，此外，小鼠缺血侧皮层发生了明显的水肿[(11.2±0.5)%]。与前述神经评分检测结果一致，侧脑室注射Atg5 siRNA后，抑制自噬的保护作用并使梗死体积[(47.2±1.3)%]和水肿率[(17.1±0.8)%]明显增加(P<0.05),见图3。

Figure 3.The effects ofAtg5 siRNA on infarct volume and edema ratio in the mouse brain after MCAO. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsI/R.

图3沉默Atg5对MCAO后小鼠脑梗死体积和水肿率的影响

讨论

本研究结果显示，小鼠脑缺血再灌注损伤后半影区Atg5和beclin-1 mRNA的表达增加，Atg5 siRNA降低Atg5 mRNA的表达。与此同时，缺血再灌后Atg5蛋白表达水平增高，Atg5 siRNA也可降低Atg5蛋白表达。Atg5 siRNA使MCAO后神经行为学损伤进一步加重。Atg5 siRNA也使缺血再灌后脑梗死体积和水肿率明显增加。上述结果表明Atg5在小鼠脑缺血再灌性损伤后具有神经保护作用。

缺血性脑损伤，包括缺血核心区及其周围的缺血半影区。缺血半影区是由侧枝循环提供的血液低灌注区域，部分地维持了神经细胞代谢和信号转导功能，主要以细胞凋亡、自噬等为主，但在一定时间内仍具有代谢活性，其损害是可逆的，能够通过及时治疗得到挽救[13]。有研究报道，新生大鼠缺氧缺血后beclin-1蛋白水平和阳性细胞数量显著增高和增加，应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤和渥曼青霉素可加速神经细胞坏死，而应用自噬激活剂雷帕霉素可减少细胞坏死并减轻脑损伤，提示自噬具有神经元保护作用[14]。Koike等[15]在新生和成年小鼠缺氧缺血模型中发现，LC3-II蛋白水平显著升高，电子显微镜显示海马锥体细胞层自噬体形成以及海马神经元广泛死亡，而Atg7基因缺陷小鼠的神经元死亡显著减少，说明自噬参与了缺氧缺血导致的神经元损伤。而本实验中Atg5蛋白水平显著升高，干扰Atg5后小鼠脑梗死体积和水肿率显著增加。结果的差异可能是由于实验动物、缺血模型及对自噬的抑制靶点不同。

Atg5是参与自噬调控的重要基因，Atg5在自噬体形成前期参与形成了自噬共轭连接体Atg12～Atg5从而促进了自噬体膜结构的延伸和自噬体的形成。在酵母和哺乳动物中敲除Atg5基因能阻滞自噬进程[16]。也有研究对自噬基因Atg5缺陷鼠实施中枢神经系统缺血-缺氧实验，与无基因缺陷鼠进行比较，结果显示基因缺陷鼠不发生自噬并且大脑和小脑大部分皮质神经元死亡，说明Atg5可能通过调节自噬对神经元起保护作用[17]。我们的研究通过RNA干扰技术下调缺血小鼠脑内Atg5的表达，可以减轻MCAO后再灌注脑损伤。这是首次明确Atg5在小鼠再灌注脑损伤中的作用。

总之，我们的研究证实Atg5 siRNA可能通过抑制自噬而加重小鼠再灌注脑损伤。然而，由于缺血时间、部位以及干预时间窗的影响，自噬在脑缺血后神经元死亡中的作用仍需要进一步研究。

[参考文献]

[1]郭倩，余音，潘乾广，等. 白藜芦醇保护脑缺血辕再灌注损伤与自噬关系的研究[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(7):995-998.

[2]苏静缘，赵瑞波. 脑缺血自噬研究进展[J]. 实用医学杂志, 2013, 29(1):151-153.

[3]Su J, Zhang T, Wang K, et al. Autophagy activation contributes to the neuroprotection of remote ischemic perconditioning against focal cerebral ischemia in rats[J]. Neurochem Res, 2014, 39(11):2068-2077.

[4]Zhang X, Yan H, Yuan Y, et al. Cerebral ischemia-reperfusion induced autophagy protects against neuronal injury by mitochondrial clearance[J]. Autophagy, 2013, 9(9):1321-1333.

[5]Yousefi S, Perozzo R, Schmid I, et al. Calpain-mediated cleavage of Atg5 switches autophagy to apoptosis[J]. Nat Cell Biol, 2006, 8(10):1124-1132.

[6]Kuma A, Hatano M, Matsui M, et al. The role of autophagy during the early neonatal neonatal starvation period[J]. Nature, 2004, 432(7020):1032-1036.

[7]彭志锋. 下调miR-181b在小鼠缺血性脑损伤中的神经保护作用[J]. 中国病理生理杂志, 2015, 31(2):224-228.

[9]Ashwal S,Tone B,Tian HR, et al.Core and penumbral nitric oxide synthase activity during cerebral ischemia and reperfusion[J]. Stroke,1998,29(5):1037-1046.

[10]Rogaev EI. Small RNAs in human brain development and disorders[J]. Biochemistry (Mosc), 2005, 70(12):1404-1407.

[11]刘旭，封素娟，张彩艳，等. 低氧预适应对小鼠缺血脑的保护及其p38 MAPK机制的实验研究[J]. 首都医科大学学报, 2009, 30(5):643-647.

[12]江君，杨巍巍，张楠，等. 低氧预适应减轻脑中动脉阻塞所致小鼠缺血性脑损伤[J]. 基础医学与临床, 2009, 29(2):113-118.

[13]Xu M, Zhang HL. Death and survival of neuronal and astrocytic cells in ischemic brain injury: a role of autophagy[J]. Acta Pharmacol Sin, 2011, 32(9): 1089-1099.

[14]Carloni S, Buonocore G, Balduini W. Protective role of antophagy in neonatal hypoxia-ischemia induced brain injury[J]. Neurobiol Dis, 2008, 32(3):329-339．

[15]Koike M, Shibata M, Tadakoshi M,et al. Inhibition of autophagy prevents hippocampal pyramidal neuron death after hypoxic-ischemic injury[J]. Am J Pathol, 2008, 172(2):454-469.

[16]Mizushima N, Su ta H, Yoshimori T, et al. A new protein conjugation system in human: the counterpart of the yeast Apg12p conjugation system essential for autophagy[J]. Biol Chem, 1998, 273(51):33889-33892.

[17]Hara T, Nakamura K, Matsui M, et al. Suppression of basal autophagy in neural cells causes neurodegenerative disease in mice[J]. Nature, 2006, 441(7095):885-889.

(责任编辑： 陈妙玲， 罗森)

Knockdown of Atg5 aggravates cerebral ischemia and reperfusion injury in mice

PENG Zhi-feng1, WANG Xi-ying2, YANG Jing-hui1

(1DepartmentofPhysiology,2InstituteofMicroorganismandImmunology,SchoolofMedicine,ShanxiDatongUniversity,Datong037009,China.E-mail:pzf181@126.com)

[ABSTRACT]AIM: To study the role of autophagy-related gene 5 (Atg5) in cerebral ischemia and reperfusion injury in mice. METHODS: BALB/c male mice (weighing 18～22 g) were randomly divided into sham group, ischemia/reperfusion (I/R) group, Atg5 siRNA group and control siRNA group. Focal cerebral ischemia was performed using the method of middle cerebral artery occlusion (MCAO) for 60 min and reperfusion for 24 h. In siRNA group and control group, 5 μL Atg5 siRNA or scrambled siRNA was administered by intracerebroventricular injection 24 h before MCAO. The expression of Atg5 at mRNA and protein levels in ischemic cortex at 24 h after reperfusion was determined by real-time PCR and Western blot. The infarct volume and edema were evaluated by TTC staining, and motor deficits were evaluated by neurological scoring. RESULTS: The expression of Atg5 at mRNA and protein levels was significantly increased 24 h after reperfusion in I/R group compared with sham group. Atg5 siRNA obviously decreased the expression of Atg5 at mRNA and protein levels induced by I/R. Inhibition of Atg5 exacerbated the infarct volume and ameliorated the neurological symptoms. CONCLUSION: Atg5 has neuroprotective effect on focal cerebral ischemia and reperfusion injury.

[KEY WORDS]Autophagy-related gene 5; Autophagy; Ischemia-reperfusion injury

[文章编号]1000- 4718(2016)01- 0064- 05

[收稿日期]2015- 06- 25[修回日期] 2015- 10- 11

*[基金项目]山西大同大学博士科研启动经费;山西省基础研究项目(No.2015021178)

通讯作者△Tel: 0352-6205665; E-mail: pzf181@126.com

[中图分类号]R363.1

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.01.011