RP-HPLC法同时检测短梗五加果中4个有效成分的含量*

孟永海，王欣慰，吴高松，翟春梅，杨春娟，宋　洋，王知斌（教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040）



RP-HPLC法同时检测短梗五加果中4个有效成分的含量*

孟永海，王欣慰，吴高松，翟春梅，杨春娟，宋洋，王知斌*
（教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040）

摘要：目的：建立反相高效液相色谱-紫外法测定短梗五加果中4个有效成分含量。方法：采用Diamasil C18色谱柱（200×4.6mm,5μm），以乙腈-0.05%磷酸为流动相，流速为1mL·min-1，检测波长为210nm，柱温为25℃。结果：短梗五加果中4个有效成分的分离度良好，标准曲线在检测范围内均呈良好线性，r=0.9997～0.9999，平均回收率95.6%～101.6%，RSD为2.4%～3.3%。结论：该方法简便可靠，精密度高，重复性好，适用于短梗五加果有效成分含量测定方法。

关键词：短梗五加果；有效成分；高效液相色谱法

短梗五加果（Acanthopanaxsessiliflorus fruits）为五加属植物的成熟干燥果实，具有强筋骨、补肝肾等功效。现代中药化学研究表明药材中含有绿原酸、原儿茶酸等酚酸类化合物，槲皮素、金丝桃苷等黄酮类化合物和短梗五加苷B、D等木脂素类化合物［1-5］。药理学研究中，表明酚酸类化合物成分有抗炎、抗焦虑、镇静等药理作用［6］，本实验对短梗五加果有效成分的测定方法进行了研究，为短梗五加果的质量控制和深入研究提供科学依据。

1　实验部分

1.1材料与仪器

安捷伦1110高效液相色谱仪、安捷伦1110紫外检测器（Agilent公司），DL-180超声仪（浙江省海天电子仪器厂）；SZ-93重蒸水仪、RE-52旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；METTLER TOLEDO电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司）。

乙腈、甲醇（色谱纯，江苏汉邦科技有限公司），醋酸、甲酸、甲醇、正丁醇（分析纯），重蒸水（自制），原儿茶酸对照品（中国药品生物制品检验所提供），短梗五加苷D、东莨菪苷（自制，采用峰面积归一化法，纯度大于98%）、（-）-pinoresinol-4,4'-di-O-β-D-glucopyranoside（PDG）。本实验分别收集了短梗五加果青果（采收时间: 9月）和成熟果实（采收时间: 10月），购于五加高新农业科技开发公司丹东农业科学院提供。

1.2色谱条件

色谱柱：Diamasil C18（迪马公司，200× 4.6mm，5μm）；流动相：乙腈-0.05%磷酸，梯度洗脱程序：9/91（0～14min），14/86（14～22min），18/82 （22～30min），流速：1mL·min-1；柱温：25℃；检测波长：210nm；进样量：20μL。

1.3对照品溶液的制备

精密称定适量原儿茶酸、东莨菪苷、PDG、短梗五加苷D，置于10mL容量瓶中，用70%甲醇溶解，摇匀，定容至刻度，制得对照品储备液浓度：1.04 mg·mL-1原儿茶酸、1.08mg·mL-1东莨菪苷、2.21mg· mL-1PDG、1.22mg·mL-1短梗五加苷D。分别精密量取原儿茶酸、东莨菪苷、PDG、短梗五加苷D对照品储备液1.0mL，置25mL量瓶中，加70%甲醇摇匀，定容，制成对照品的混合溶液。

1.4供试品溶液的制备

取短梗五加果药材，粉碎后过筛，精密称取粉末1.0g，置于100mL三角形锥形瓶中，加正丁醇40mL，超声处理30min，抽滤，提取2次，合并滤液，制成浸膏，用70%甲醇定容至10mL量瓶中，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，续滤液即为供试品溶液。

1.5线性范围考察

精密吸取对照品混合溶液0.5、2.0、4.0、6.0、8.0mL分别置于10mL容量瓶中，用70%甲醇摇匀，定容。精密吸取对照品溶液和对照品混合溶液各20μL，注入HPLC色谱仪中，以质量浓度（μg· mL-1）为横坐标（x），色谱峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线。原儿茶酸回归方程为y=126.1x-79.87，r=0.9997，线性范围为2.08～33.28g·mL-1，东莨菪苷回归方程为y=50.90x-9.919，r=0.9998，线性范围为2.16～34.56g·mL-1，PDG回归方程为y=36.09x-6.289，r=0.9999，线性范围为2.42～38.72g·mL-1，短梗五加苷D回归方程为y=88.82x-49.77，r=0.9995，线性范围为2.44～39.04g·mL-1。

1.6精密度试验

精密称取短梗五加果药材粉末4份，按“1.4”项下方法制备供试溶液，按“1.2”项下HPLC色谱条件进样分析，计算各成分含量的RSD：原儿茶酸2.7%、东莨菪苷2.6%、PDG 2.0%、短梗五加苷D 2.7%、均小于3.0%，表明该方法的重复性良好。

1.7稳定性试验

取同一供试品溶液，在室温放置，分别于0, 2, 4, 8, 12, 24h进样分析，所测定的4个成分色谱峰峰面积的RSD在12h内均小于3.0%，说明在12h内供试品溶液稳定。

1.8加样回收率试验

称取短梗五加果粉末4份各0.5g，分别加入相当于所测成分含量100%的混合对照品溶液适量，按“1.4”项下方法制备供试溶液，按“1.2”项下HPLC色谱条件进样分析，计算回收率，结果原儿茶酸平均回收率95.6%，RSD=3.3%（n=6），东莨菪苷平均回收率99.0%，RSD=2.9%（n=6），PDG平均回收率99.4%，RSD=2.5%（n=6），短梗五加苷D平均回收率101.6%，RSD=2.4%（n=6）。

1.9样品的含量测定

取三批供试品溶液和“1.5”项下方法制备对照品混合溶液20μL，按“1.2”项下HPLC色谱条件进样分析，结果见色谱图1。

取三批短梗五加青果和成熟期果实约1.0g，各3份，按“1.4”项下方法制备供试溶液，按“1.2”项下HPLC色谱条件进样分析，结果见表1。

图1　色谱图Fig.1 Typical chromatograms of reference compounds （a）and samples（b）

表1　短梗五加果中4个成分含量测定结果（n=3）Tab.1 The mean contents of four analytes in the A. sessiliflorus fruits（n=3）

2　结果

本实验建立了RP-HPLC法同时测定短梗五加果中4个活性成分的含量，检测结果表明：青果中不含有原儿茶酸和东莨菪苷，而成熟果实果实和青果中均含有PDG和短梗五加苷D。

3　讨论

3.1检测波长选择

由紫外扫描知木脂素类化合物的最大吸收波长为210nm，原儿茶酸等在210nm处有末端吸收，为了兼顾所有化合物同时测定，增加检测灵敏度，故选择210nm作为检测波长。流动相选择：由于水相中加入H3PO4基线平缓，待测样品的理论踏板数较高，所以选择加入H3PO4，且加入0.05%的H3PO4，相邻色谱峰均达到基线分离。同时，选择乙腈为有机相可有效减少噪音干扰。提取溶剂选择：不同浓度的甲醇、乙醇可将药材中大量的色素提取出来，而正丁醇萃取后干扰峰较少，所以提取溶剂选择水饱和正丁醇。提取方法的选择：实验采用正交实验多次考察表明，提取时间对结果无显著影响，为了节约时间和溶剂的用量，检测方法使用的提取时间选择30min，用量选择40mL，而提取2次杂质峰较少，且提取率没有显著性差异。最终确定提取方法为水饱和正丁醇40mL，超声处理30min，提取2次。本文建立的方法简便可靠，重复性好，为短梗五加果有效成分的含量测定提供了有利的依据。

3.2流动相选择

为了提高灵敏度，减少噪音干扰，有机相选择本底较低的乙腈。由于水相中加入磷酸基线平缓，所以选择加入H3PO4，且加入0.05%的H3PO4，相邻色谱峰均达到基线分离。

3.3提取溶剂选择

不同浓度的甲醇、乙醇可将药材中大量的色素提取出来，而水饱和正丁醇干扰峰少，所以提取溶剂选择水饱和正丁醇。

3.4提取方法的选择

实验采用正交实验多次考察表明，提取时间对结果没有显著影响，为了升高提取率，节约时间和用量，提取时间选择30min，提取用量选择40mL，而提取2次杂质峰较少，且提取率没有显著性差异。最终确定提取方法为水饱和正丁醇40mL，超声处理30min，提取2次。

4　结论

本文建立的方法简便可靠，重复性好，为短梗五加果有效成分的含量测定提供了有利的依据。

参考文献

［1］安琪,杨春娟,宋洋,等.无梗五加果化学成分的研究［J］.天然产物研究与开发, 2008, 20: 765-769.

［2］郭晓璐,师子明,齐文,等.刺五加果TLC鉴别及原儿茶酸、绿原酸、金丝桃苷的含量测定［J］.沈阳药科大学学报, 2015, 32 （8）: 618-622.

［3］韩莹.无梗五加果化学成分的分离分析及大鼠体内动力学研究［D］.沈阳:沈阳药科大学, 2006: 1.

［4］史伟国,崔立勇,佟庆,等.响应面法优化短梗五加中刺五加苷B和E的超声提取工艺［J］.安徽农业科学, 2014, 42（18）: 5747-5748.

［5］王祝伟.红毛五加化学成分及其多维指纹图谱研究［D］.沈阳:沈阳药科大学, 2005: 42-44.

［6］Bouayed J, Rammal H, Dicko A, et al. Chlorogenic acid, a polyphenol from Prunus domestica（Mirabelle）, with coupled anxiolytic and antioxidant effects［J］. Journal of the Neurological Sciences, 2007, 262（1-2）: 77-84.

Simultaneous determination of four effective compounds of Acanthopanax sessiliflorus fruits by RP-HPLC*

MENG Yong-hai，WANG Xin-wei，WU Gao-song，ZHAI Chun-mei，YANG Chun-juan，SONG Yang，WANG Zhi-bin*
（Key Laboratory of Chinese Materia Medica（Ministry of Education）, Heilongjiang Key Laboratory of TCM Pharmacidynamic Material Bases, Heilongjiang University of Chinese Medicine, Harbin 150040, China）

Abstract：Objective: To establish a RP-HPLC-UV method for the determination of four effective compounds of Acanthopanax sessiliflorus. Methods: Chromatographic conditions were gave on an C18column（200×4.6mm, 5μm）at 25℃, an isocratic mobile phase consisting of acetonitrile-0.05%phosphoric acid solution at a flow rate of 1mL·min-1and 210 nm detection wavelength. Results: four effective compounds of Acanthopanax sessiliflorus had good separating and linearity. The linear range of four effective compounds was wide（r=0.9997～0.9999）, the average recovery was 95.6～101.6%and RSD was 2.4～3.3%. Conclusion: The method is simple and reliable, high precision, good reproducibility, and accurate for the quantitative analysis of four effective compounds of Acanthopanax sessiliflorus.

Key words：the Acanthopanax sessiliflorus fruits；active compounds；HPLC

中图分类号：R284

文献标识码：A

DOI：10.16247/j.cnki.23-1171/tq. 20160527

收稿日期：2015-12-01

基金项目：黑龙江省青年科学基金项目（QC2012C064）；国家自然科学基金青年科学基金项目（81303195）；国家重点基础研究发展计划（973计划）2013CB531801

作者简介：孟永海（1978-），男，博士，副教授，从事中药药效物质基础和质量控制研究。

通讯作者：王知斌（1976-），男，副教授，研究生导师，主要研究方向：中药及复方药效物质基础研究和新药临床前药学研究。