子痫前期患者外周血IGH-CDR3免疫组库的变化

郭昌龙　于　松　王启迪　曹小芳　杨　英　刘　昕,3　彭左旗　蔡瑞琨

安丽莎1　杜　蒙1,4　邱　月1,4　王兴宇1,3　马　旭1,*

1. 国家卫生计生委科学技术研究所(北京，100081)； 2.首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院； 3. 北京高血压联盟研究所；4.北京协和医学院研究生院



·基础研究·

子痫前期患者外周血IGH-CDR3免疫组库的变化

郭昌龙1于松2王启迪1曹小芳1杨英1刘昕1,3彭左旗1蔡瑞琨1

安丽莎1杜蒙1,4邱月1,4王兴宇1,3马旭1,*

1. 国家卫生计生委科学技术研究所(北京，100081)； 2.首都医科大学附属北京妇产医院/北京妇幼保健院； 3. 北京高血压联盟研究所；4.北京协和医学院研究生院

摘要目的：探讨子痫前期患者外周血中IGH-CDR3序列的多样性与免疫学特性。方法：分离子痫前期患者外周血中的B淋巴细胞，逆转录为cDNA后用ARM-PCR扩增H链CDR3区序列，利用高通量测序并与IMGT数据库对比揭示子痫前期患者IGH-CDR3受体库的多样性及免疫学特征。结果：5例子痫前期患者外周血IGH-CDR3 的数目和种类差别较大，从1127条read到47385 read；子痫前期患者有独有的免疫学特性，包括IGH-CDR3 长度、N末端碱基的添加数、V、J区域使用偏好基因及末端去除的碱基数；子痫前期患者外周血中存在某些寡克隆异常增殖的情况。结论：子痫前期患者外周血IGH-CDR3 免疫组库有其独有的特点。

关键词子痫前期；免疫组库；IGH-CDR3

妊娠期高血压疾病(HDCP)是妇女妊娠期所患有的高血压疾病统称，分为妊娠期高血压、子痫前期、子痫、慢性高血压并发子痫前期以及慢性高血压[1]。子痫前期是妊娠期高血压疾病中较重的类型，对母婴安全是一个严重的威胁，同时也是导致孕产妇及围生儿死亡的主要原因之一，围生儿死亡率可高达15%～30%[2]。目前研究显示除年龄过大或过小(或>40岁<18岁)、多胎妊娠、社会经济状况差、抗憐脂综合征、妊娠期高血压病史及家族史、营养不良[3]等流行病学高危因素外[4]，子痫前期有4个主要的发病机制学说，包括胎盘或滋养细胞缺血学说、遗传学说、氧化应激学说、免疫学说[5]。近年来的基础研究表明，妊娠的成功有赖于母胎免疫平衡，一旦免疫平衡失调，即可引起免疫排斥反应而导致子痫前期和先兆子痫。子痫前期与免疫反应相关的有力证据包括螺旋小动脉发育受阻于黏膜段(胎盘浅着床)，且螺旋小动脉管壁出现急性粥样硬化病变[6]；患者血管壁上可见明显的免疫球蛋白IgM和补体C3沉积[7]；补体1q越低，补体5b-9显著增高[8]；90%子痫前期患者胎盘组织缺乏HLA-G抗原表达或表达程度下降等[9]。B 细胞是介导机体体液免疫应答的主要细胞群，其识别、结合抗原主要依赖互补决定区(CDR)，它决定着抗体的特异性, 而互补决定区3(CDR3)比CDR1、CDR2 更具多样性[1]，通过观察机体B 细胞CDR3 受体库的多样性、CDR3区的基因/氨基酸组成特征、各亚家族的偏向取用等，可以观察生理及病理状态下机体免疫的相关情况[10]。本研究利用最新出现的IGH-CDR3免疫组库技术结合高通量测序技术研究子痫前期患者外周血中存在的CDR3序列，期待进一步全面揭示子痫前期的发生、发展机制，发现新的免疫相关分子。

1 对象与方法

1.1 研究对象

本研究中所选取的5例子痫前期孕妇外周血标本均从北京妇产医院获得，子痫前期孕妇的诊断标准为：①收缩压≥160 mmHg和(或)舒张压≥110mmHg；②24h蛋白尿≥2.0g，或随机蛋白尿(++)以上；③出现持续性头痛、视觉障碍等脑神经症状者；④肝功受损，血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平升高；⑤出现上腹部疼痛，肝破裂、肝包膜下血肿等症状；⑥血小板持续性下降，<100x109/L；发生血管内溶血、贫血等；⑦出现低蛋白血症，伴发腹水、胸水等；⑧少尿、血肌酐>106μmol/L；⑨发生肺水肿、心衰；⑩在妊娠34周以前即发病；⑾胎儿宫内发育迟缓、B超提示羊水过少。本研究严格遵守赫尔辛基宣言，所有血液标本的取得都获得了孕产妇本人的同意并签署了知情同意书，同时本研究获得了北京妇产医院与本所伦理委员会的同意。

1.2 PBMC分离、RNA提取、ARM-PCR扩增、高通量测序

分别采集每个研究对象的外周静脉血8ml，肝素钠抗凝后用Ficoll法分离出淋巴细胞，细胞重悬于RNA保护液并冻存于-80℃备用。RNA的提取按照Qiagen公司的离心柱法。取1μg total RNA逆转录为cDNA，利用iRepertoire公司的HBHI-M的引物试剂盒对IGH重链区域进行两步PCR扩增反应，第一步反应条件如下：50℃，40min；95℃，15min；94℃，30s，63℃，2min，72℃，30s，15cycle；94℃，30s，72℃，2min，10cycle；72℃，10min。第一步PCR结束后取2ul反应产物作为第二步PCR的模板，反应条件如下：95℃，15min；94℃，30s，72℃，90s，30cycle；72℃，5min。PCR产物经琼脂糖电泳检测扩增效果并切下490-570bp大小的片段做胶回收，回收产物定量后用二代测序仪Miseq进行测序反应。

1.3 生物信息学分析

将测得的原始测序数据上传到iRepertoire公司的网站由专业的生物信息人员进行统计分析，具体步骤包括：①去除掉数据中的冗余序列、短片段序列及测序质量差的序列；②将数据与公共数据库IMGT(http://www.imgt.org/)进行比对查询，根据IGH-CDR3区域V、J、D各区段的特点鉴定出各个样本的CDR3肽段序列；③统计各样本的免疫学特征。

2 结果

2.1 研究对象

5例研究对象病例信息见表1。5例样本均成功地扩增出了外周血IGH-CDR3免疫组库，各样本中的CDR3数量和种类均不一致，变异范围较大，经分析未发现患者的临床特征与CDR3数量和种类具有相关性(表1)。

2.2 IGH-V、-J基因家族的使用偏好性和其他免疫特征

通过与IMGT数据库对比发现，5例子痫前期样品有独特的免疫学特性，且同一特性在各样本间变异范围较大，规律性较差(图1)。具体为：CDR3区域的长度主要为39bp(14.42%)、48bp(11.42%)、45bp(10.58%)，分布对应于13、16、15个氨基酸(图1-A)；N末端添加的碱基数从0到40bp呈高斯分布，频率最高的碱基数分别为12(6.34%)、9(6.22%)、13(5.38%)、10(5.04%)、11(4.82%)(图1-B)；J末端去除的碱基数主要是0(15.68%)、6(10.78%)、9(7.66%)、5(7.62%)、4(7.58%)(图1-C)，而J基因使用频率的顺序为J4(43.52%)、J6(19.72%)、J3(19.66%)、J5(11.86%)、J1(3.56%)、J2(1.7%)(图1-D)；V末端去除的碱基数主要是0(43.24%)、1(18.86%)、4(9.62%)、2(8.96%)(图1-E)，而V基因区域本研究中共检测到V1-7 7个家族共48个亚基因的使用情况，使用频率的顺序为V1-18(9.14%)、V3-23(9.1%)、V3-30-3(8.32%)、V3-30(7.62%)、V4-59(7.62%)(图1-F)。

表1　5例子痫患者的病例信息

图1子痫前期患者外周血IGH免疫学特征

2.3 各样本表达频率最高的10个IGH-CDR3肽段

IGH-CDR3序列是BCR分子与抗原结合的主要部分，决定了B细胞与抗原结合的特异性和强度，而外周血中存在的IGH-CDR3种类与数量又反映了个体的抗原接触史和机体的免疫能力。通过与IMGT数据库对比，本研究鉴定出了5例研究对象外周血中表达的IGH-CDR3肽段，范围从118(样本E)到6844(样本C)种肽段(表1)，同时也发现5例均存在不同程度的特定IGH-CDR3克隆过度增殖的情况。例如样本A中，虽然其全部的CDR3 read数目有4839个，但其中2031个拷贝(占全部41.97%)均表达ARDGEFFNDAFDL肽段，而其表达量最高的10个CDR3肽段占全部的CDR3总数的62.22%(3011/4839)。提示该患者的免疫系统正在清除某些抗原对机体的损害，尤其是与ARDGEFFNDAFDL序列结合的抗原的侵袭；样本B中表达ATESPNTELDY肽段的拷贝数占全部CDR3 read的12.17%；样本C中表达量最高的ARDKGTVCLDY拷贝数占全部CDR3 read的1.06%；样本D中ARDRRKFTTGSGPDYYGMDA的拷贝数占全部的4.93%；样本E中ARGLSGSRYEASDY的拷贝数占全部的12.33%(表2)。

表2　5例研究对象样本中表达频率最高的10个IGH-CDR3肽段

3 讨论

B淋巴细胞主要介导机体体液免疫应答, 其通过细胞表面的BCR分子识别、结合抗原，产生特异性抗体，保护机体免受外界抗原的损害。在B细胞发育过程中，胚系DNA通过“Dn-Jn-Cn”基因重排形成CDR1、CDR2、CDR3三个高变区，而CDR3 区是多样性最高的区域，也是决定B 细胞识别抗原肽的关键部位[11]。目前已知多种因素都可以影响CDR3的多样性，包括重链、轻链的类型，重、轻链配对组合，N末端碱基的随机插入，V、J末端核酸的去除，免疫球蛋白类型转换及体细胞高频突变等都能促成其多样性形成[12]，所以据推测在生理状态下B细胞IGH-CDR3多样性可以达到1011种以上[13]，使得正常情况下机体几乎能对所有侵入机体的异物产生应答[11]。所以通过分析B 细胞IGH-CDR3库可以监测和分析生理及病理状态下机体的免疫状况，对于了解疾病的发生、发展、诊断和治疗提供新思路、新方法。

本研究首次利用高通量测序技术对子痫前期患者外周血IGH-CDR3库进行了筛查，并系统全面地阐述了其IGH-CDR3库的免疫学特征。尽管已经证实免疫失衡可以导致子痫前期的发生，但是在本研究中5例子痫前期患者IGH-CDR3库仍存在较大的变异，CDR3 read数从1127到47386，二者相差47倍，而CDR3种类最高与最低的则相差58倍(6844/118)。另外体现IGH-CDR3多样性的重要指标-CDR3 种类与CDR3 read数目的比值，在5例样本中的变异也较大，最高值与最低值的比值为2.77(0.158/0.057)。表明子痫前期疾病虽然与体液免疫反应高度相关，但此期孕妇外周血中的IGH-CDR3数目与多样性并没有出现整体性偏移，仍存在非常高的多样性。另外值得注意的是5例患者体内均出现个别克隆异常增殖的情况，拷贝数最高的克隆可以达到5768个，提示该患者的免疫系统正在清除体内可以与ATESPNTELDY肽段相结合的抗原的损害，同时也证明这5例患者的免疫系统处于活化的状态。但是这5例患者表达量最高的10种CDR3肽段间却没有完全相同的序列，所以据此初步推测这5例患者体内没有相同抗原和(或)致病原的存在。但是也不能排除另外一种可能性，即同一个外源蛋白经抗原提呈作用后会产生多个序列不同、结合能力不等的抗原，机体针对同一外源蛋白的不同抗原则会产生相应不同的抗体(CDR3序列完全不同)，所以针对同一个外源蛋白，不同的人可能会有CDR3序列不同的抗体序列。同时，子痫前期患者IGH-CDR3仍然有一些特异的免疫学特性，正如本文中所呈现的那样，包括CDR3区长度主要为13、16个氨基酸，N末端添加核苷酸数的频率最高为12(6.34%)，V、J末端去除的碱基数主要是0(43.24%、15.68%)，J基因使用频率最高的是J4(43.52%)，V基因使用频率最高的前3个亚家族是V1-18(9.14%)、V3-23(9.1%)、V3-30-3(8.32%)。

综上所述，本研究利用ARM-PCR扩增与高通量测序技术成功的展示了5例子痫前期患者IGH-CDR3序列的多样性及免疫学特性，为全面揭示免疫失衡在子痫前期发病和治疗中的作用提供了一定的基础。

参考文献

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[责任编辑：董琳]

The change on immunorepertoire of IGH CDR3 in peripheral blood of patients with preeclampsia

GUO Changlong1, YU Song2, WANG Qidi1, CAO Xiaofang1, YANG Ying1, CAI Ruikun1, AN Lisha1, DU Meng1, QIU Yue1, WANG Xingyu1,3, MA Xu1,*

1.NationalResearchInstituteforFamilyPlanning,Beijing100081; 2.Beijingobstetricsandgynecologyhospital,Capitalmedicaluniversity.Beijingmaternalandchildhealthcarehospital; 3.BeijinginstituteofhypertensionleagueCorrespondingauthor:MAXu,Email:xjmagroup@163.com

AbstractObjective: To investigate the diversity and immunological characteristics of IGH CDR3 in peripheral blood of patients with preeclampsia. Methods: B lymphocyte was separated from peripheral blood of patients with preeclampsia, cDNA was reversed from RNA, and then IGH CDR3 region was amplified by ARM PCR. The corresponding PCR products were sequenced using the high throughput sequencing and blasted with the IMGT database. Results: There were difference on the number and species of IGH CDR3 in peripheral blood of five patients with preeclampsia, which range were from 1127 reads to 47385 reads; Patients with preeclampsia had unique immunological characteristics, which including IGH-CDR3 length, NT of N addition, usage bias of V and J gene, and NT of V and J removal; There was some abnormal proliferation of CDR3 peptides in peripheral blood of patients with preeclampsia. Conclusion: Immunorepertoire of IGH-CDR3 in peripheral blood of patients with preeclampsia has unique characteristics.

Key wordsPreeclampsia; Immunorepertoire; IGH-CDR3

基金项目：国家国际科技合作专项项目(2012DFB30130)、国家自然科学基金(81501418)

收稿日期：2016-02-02修回日期：2016-02-19

*通讯作者：xjmagroup@163.com

doi:10.3969/j.issn.1004-8189. 2016.03