重组抗菌蛋白Reg3γ的表达、纯化及鉴定

刘　彤，冯　野，高永建，丁大勇

(吉林大学中日联谊医院 胃结直肠肛门外科,吉林 长春130033)



重组抗菌蛋白Reg3γ的表达、纯化及鉴定

刘彤，冯野，高永建，丁大勇*

(吉林大学中日联谊医院 胃结直肠肛门外科,吉林 长春130033)

哺乳动物肠道内存在大量共生菌，这些共生菌对宿主的营养代谢有重要意义。宿主需要对肠腔内的细菌进行一定的动态防御，肠道内抗菌蛋白是肠道防御机制中重要的一项。再生蛋白3是一组由小肠paneth细胞分泌到肠腔的抗菌凝集素，大小约为16KD，包括小鼠Reg3γ和人HIP/PAP。目前，对于该类蛋白的表达和调控，各种功能的具体机制还不清楚。本文利用生物工程技术表达、纯化重组Reg3γ蛋白质，并对纯化的重组蛋白进行了鉴定，为进一步分析再生蛋白3的功能及作用机制提供了基础。

1材料与方法

1.1材料

鼠小肠cDNA库由本实验室构建保存，来源于C57BL小鼠小肠组织。载体质粒pET-30b(+)购自Novagen公司；感受态细胞DH5α、各种限制性内切酶、连接酶及DNA聚合酶购自TaKaRa公司；真核表达大肠杆菌E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL购自Agilent Technologies公司；透析袋(MWCO 6,000-8,000)购自Spectrum Laboratories公司；SP Sepharose Fast Flow 阳离子交换柱及SephacrylTMS-200 HR凝胶过滤柱购自GE Healthcare；兔抗鼠Reg3γ抗体购自Life Science INC；辣根过氧化物酶偶联二抗购自Amersham Pharmacia。

1.2实验方法

1.2.1表达载体构建根据GenBank数据库提供的鼠Reg3γ基因mRNA序列(基因号NM_011260.1)，利用Primer Express version.1.5设计引物。Reg3γ上游引物：5′-ATTGCGAGGCATATGGAAGTTGCCAA GAAAGATGCCCCAT -3′；Reg3γ下游引物：5′- CTATGGGGATCCCTAGGCCTTGAATTTGCAG ACATAGGGT -3′ 。上游引物包含NdeI酶切位点(用下划线表示)，下游引物包含BamHI酶切(用下划线表示)。PCR反应条件为：94℃2分后94℃20秒、60℃30秒、72℃30秒行30个循环，最后72℃5分。

将pET-30b(+)质粒和Reg3γPCR产物进行双酶切。使用DNA连接酶将预处理的目的片段和载体连接成为重组质粒pET-30b(+)-Reg3γ，重组质粒扩增抽提后，行质粒双酶切鉴定及测序。热冲击法将经过鉴定的重组表达质粒转化工程大肠杆菌E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL，应用含卡那霉素和氯霉素的双抗LB培养基筛选，完成表达载体的构建。

1.2.2重组蛋白的小量制备及实验条件确定从转化的表达细菌平板上挑菌到1 ml LB液体培养基(含有卡那霉素30 μg/ml和氯霉素50 μg/ml)，37℃振荡培养过夜。取培养过夜的菌液50 μl加入新的3 ml LB液体培养基内，37℃振荡培养2-4小时，使细菌OD达到0.6。菌液中加入0.5 mM IPTG后继续37℃振荡培养2-6小时。收集菌液4℃6 500 g离心15分钟，收集沉淀的细菌。细菌沉淀以清洗缓冲液重悬，以超声破碎器将细菌破碎，4℃10 000 g离心10分钟，沉淀和上清行SDS-PAGE检测，确定重组蛋白的可溶性。调整培养诱导时间和IPTG浓度，确定最佳的表达条件。

1.2.3重组蛋白质的大量表达根据小量制备的条件进行重组蛋白质的大量表达。从转化的表达细菌平板上挑菌到20 ml LB液体培养基，37℃振荡培养过夜。将培养过夜的菌液加入500 ml LB液体培养基内，37℃振荡培养4小时，使细菌OD达到0.6。菌液中加入0.5mM IPTG后继续37℃振荡培养6小时。菌液加入10枚50 ml离心管，4℃6 500 g离心15分钟，弃去上清液。各离心管细菌沉淀以2.5 ml 清洗缓冲液重悬。收集菌液至5枚50 ml离心管中，每枚5毫升。1分钟，分2次以超声细胞破碎器将细菌破碎。将细菌破碎液收集到4枚15 ml离心管中，4℃10 000 g离心10分钟，弃上清，沉淀部分以清洗缓冲液重悬，以匀浆器匀浆2次。4℃10 000 g离心10分钟，弃上清，沉淀以重悬缓冲液(2.5 ml×4)重悬，室温下振荡2小时。将重悬液缓慢滴入复性缓冲液中，4℃缓慢搅拌24小时。

1.2.4重组蛋白的纯化以上表达蛋白及复性液在室温下10 000 g离心30分钟，留取上清液，加入透析袋中。将透析袋放入5L透析缓冲液中， 4℃透析24小时，过滤复性液体中小分子杂质。使用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换柱和SephacrylTMS-200 HR凝胶过滤柱来纯化重组蛋白。

1.2.5SDS-PAGE及Western Blotting检测取重组蛋白样品20 μl上样，用5%浓缩胶和15%分离胶行SDS-PAGE电泳，电泳条件为定电流5 mA 20分钟,20 mA 90分钟。电泳后的凝胶根据需要行考马斯亮蓝染色或Western Blotting检测。Western Blotting检测中Reg3γ抗体浓度1∶2 000，二抗浓度为1∶1 000。

2结果

2.1表达载体构建

通过PCR进行扩增的目的基因行琼脂糖凝胶电泳显示扩增出的条带大小与理论值(474 bp)推测基本相符(图1)。

pET-30b(+)质粒及PCR后回收的基因片段经NdeI和BamHI双酶切后连接通过DNA连接酶连接成为重组质粒pET-30b(+)-Reg3γ。为了进一步确定重组质粒的正确插入，我们进行重组质粒抽提纯，行双酶切鉴定。酶切后DNA电泳图谱可见两段片段，与理论大小一致(图2)。

2.2重组蛋白的小量制备及实验条件确定

为确定表达细菌E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL的转化成功及重组蛋白在大肠杆菌中的表达位置，我们进行重组蛋白Reg3γ的小量制备。在表达过程中，选取未加IPTG诱导菌液、IPTG诱导菌液、菌液离心的上清液、细菌裂解后的离心和上清液5个样本行SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色。如图3所示经IPTG诱导后，有明显16KD大小的蛋白质表达，与理论Reg3蛋白大小相符。

细菌经超声裂解后，其上清液无重组蛋白的表达，在沉淀中有目标蛋白的表达。该结果说明重组Reg3蛋白质是不溶的包涵体状态，为取得有功能的重组蛋白需要进一步行包涵体的溶解复性和纯化。通过调整培养诱导时间和IPTG浓度，确定最佳的表达条件为IPTG诱导浓度使用0.5 mM/L，IPTG的诱导时间为6小时(图4)。

2.3重组蛋白质的大量表达及纯化

根据小量制备的条件，进行重组蛋白在大肠杆菌的大量制备。大量制备所得的包涵体经过复性液复性后经透析滤出中小分子杂质。经阳离子交换层析柱纯化后仍有少许大分子杂质，所以行进一步凝胶过滤纯化(图5)。

图1小鼠Reg3γ基因PCR产物图2重组质粒 pET-30b(+)-图3重组蛋白Reg3γ的小量制备。1、未加IPTG

琼脂糖凝胶电泳，MW为Reg3γ基因酶切鉴定结诱导菌液 2、IPTG诱导后菌液 3、菌液离心

DNA分子marker。果，MW为DNA分子的上清液4、细菌经超声碎裂后的离心沉淀

marker。5、细菌碎裂后离心上清细菌裂解液上清。

M为蛋白质marker。

图4重组蛋白Reg3γ的小量制备条件。(a)IPTG图5重组蛋白Reg3γ的表达和纯化。1、未加IPTG诱导菌液

浓度对重组蛋白表达的影响。1、未诱导菌液；2、IPTG诱导后菌液 3、超声碎裂后离心上清4、包涵体经

2、IPTG 0.2 mM/L；3、IPTG 0.5 mM/L；4 IPTG 研磨清洗后离心上清5、复性蛋白质经离子交换层析柱纯

0.8 mM；(b)诱导时间对重组蛋白表达的影响。化后。M为蛋白质marker。

1、未诱导菌液；2、诱导2小时；3、诱导4小时；

4、诱导6小时。

凝胶过滤层析是根据分子大小和形状的差异进行分离的蛋白质纯化技术。不同分子按照大小顺序洗出，大分子先洗出，小分子后洗出。洗出的蛋白质按滤出的顺序分别存放在30个离心管中，如图6所示除去重组蛋白中的大分子杂质。

2.4重组蛋白的鉴定

经纯化的可溶性重组蛋白行SDS-PAGE，将凝胶中的蛋白质电转到PVDF膜上，再行免疫印记(Western-blotting)检测。如图7所示，在大小约为16 KD位置上出现了清晰的特异性条带，表明重组蛋白Reg3γ能够与相应的特异性抗体结合，从免疫学上证明了Reg3γ重组蛋白表达的正确性。

3讨论

越来越多的研究表明再生蛋白3在调节哺乳动物肠道内细菌和宿主之间的内环境稳定具有重要的意义[1]。除了抗菌作用[2]外，再生蛋白3还参与多种类型细胞的增殖和分化，具有抗凋亡和促有丝分裂等作用，与糖尿病[3]、肿瘤[4]及炎性肠道病[5]等多种疾病相关。为通过小鼠动物模型及体外深入研究再生蛋白3的功能及作用机制，本文利用生物工程技术在表达重组小鼠的Reg3γ蛋白质。我们根据GenBank数据库提供的基因序列设计引物，PCR扩增目的基因，将鼠Reg3γ基因插入pET-30b(+)质粒成功构建成重组质粒pET-30b(+)-Reg3γ。

图6重组蛋白Reg3γ经凝胶过滤柱Sepharyl S-200R的纯化。图7重组蛋白Reg3γ的Western-blotting检测。

M为蛋白质marker。1、2为重组蛋白Reg3γ，3为阴性对照

许多情况下，在表达细菌中目的蛋白聚集成不溶的没有生物活性的结构，称为包涵体。形成包涵体有利于通过离心收获相对纯净的蛋白。目标蛋白以无活性的包涵体形式表达，不会影响宿主菌的生长。Reg3γ蛋白具有抗菌作用，如果直接表达可溶的活性蛋白可能会对宿主细菌产生影响。pET-30b(+)质粒是适合表达包涵体的质粒，非常适合制备再生蛋白3这样的小蛋白。

本研究通过小量制备确定了重组Reg3γ蛋白在大肠杆菌中表达的适合条件：IPTG诱导浓度使用0.5 mM/L，诱导时间为6小时。小量制备结果显示重组Reg3γ蛋白质在大肠杆菌中表达形式是不溶的包涵体状态，与实验设计相符。变性溶解的包涵体通过透析析出小分子杂质，经离子交换层析初步纯化。离子交换层析是根据蛋白质的等电点来进行分离纯化蛋白质的方法。本实验中小鼠Reg3γ等电点为8.5，所以我们选择使用阳离子交换柱。经阳离子交换层析柱纯化后仍有少许大分子杂质，考虑为这两种重组蛋白等电点接近中性，所以分离效果欠佳。凝胶过滤层析是根据分子大小和形状的差异进行分离的蛋白质纯化技术。不同分子按照大小顺序洗出，大分子先洗出，小分子后洗出。本文重组蛋白Reg3γ经凝胶过滤后，除去重组蛋白中的大分子杂质，得到了纯化的重组蛋白。纯化的蛋白质经过Western-blotting检测进一步的到鉴定。我们进一步还需要对重组蛋白的抗菌等功能进行体外鉴定。

综上，我们的工作为进一步分析再生蛋白3的功能及作用机制提供了基础。

参考文献：

[1]Vaishnava S,Yamamoto M,Severson KM,et al. The antibacterial lectin RegⅢγ promotes the spatial segregation of microbiota and host in the intestine[J]. Science,2011,334:255.

[2]Mukherjee S,Zheng H,Derebe MG,et al.Antibacterial membrane attack by a pore- forming intestinal C-type lectin[J].Nature,2014,505(7481):103.

[3]Zhou L,Zhang R,Wang L,et al. Upregulation of REG Ialpha accelerates tumor progression in pancreatic cancer with diabetes[J]. Int J Cancer,2010,127(8):1795.

[4]Masui T,Ota I,Itaya-Hironaka A,et al. Expression of REG III and prognosis in head and neck cancer[J]. Oncol Rep,2013,30(2):573.

[5]Granlund Av,Beisvag V,Torp SH,et al.Activation of REG family proteins in colitis[J].Scand J Gastroenterol,2011,46(11):1316.

(收稿日期：2015-11-14)

*通讯作者

基金项目：吉林省财政厅资助课题

文章编号：1007-4287(2016)04-0536-04