包涵体蛋白的纯化层析复性技术研究进展

付强 吴全明 岳林涛

山西康宝生物制品股份有限公司 山西长治 046000

原核细胞表达外源基因时，其表达蛋白多会在细胞质内聚集形成包涵体，以包涵体为形态存在的蛋白质分子一般不具有正确的天然三维结构以及生物活性，因此临床在进行相关实验和研究的过程中必须通过复性操作技术对其进行复性。层析复性技术是一种蛋白质分离纯化的方法并且得到了相对广泛的应用；按照目前纯化实验中机制的不同，可将层析技术大致分为凝胶过滤层析、吸附性层析，本次研究则主要分析以上两类包涵体蛋白的层析复性技术详情（如下表1），现将研究概况做出整理报道。

表1 层析复性技术

1 凝胶过滤层析复性

凝胶过滤层析复性也称体积排阻复性或分子筛复性。和常用的稀释复性法（或透析法）比较，凝胶过滤层析复性能在较高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，其具有较高的活性回收率，因此使得目标蛋白得到较高程度的纯化[1]。因为复性过程始终在溶液中完成，这对于蛋白质的复性有利，此外在复性过程中合理选择添加剂，会使得某些蛋白质的复性效率提高，同时降低应用成本，因此还需进一步研究总结。

2 吸附性层析复性

吸附性层析复性包括离子交换层析、疏水层析、扩张床层析以及亲和层析等方法。

2.1 离子交换层析

变性蛋白质和固定相之间所带的电荷存在不同，因此变性蛋白质多吸附在固定相的表面，这使得复性过程中蛋白质的聚集作用得到避免，逐步提高洗脱液的盐浓度，变性蛋白质可洗脱出来。在进行离子交换层析复性实验时，变性剂浓度的线性减少能有效抑制聚集体的形成，并且低浓度的变性剂能有效抑制复性中间体的聚集，增加复性的收率[2]。

2.2 疏水相互作用层析

疏水相互作用层析复性是利用蛋白疏水性基团与固定相表面疏水基团之间的疏水相互作用，使蛋白疏水区被结合，降低蛋白聚集，有利于从疏水核心开始的折叠并在柱上完成复性[3]。疏水层析复性常采用高浓度盐上样及平衡，因为高盐环境会增强疏水作用而有利于吸附蛋白，但高盐环境同样会引起蛋白盐析，因此疏水层析复性前需对蛋白的盐溶液进行测试，避免堵塞层析柱。和其他的层析复性法相比较，疏水层析的固定相可促进变性蛋白质疏水核心的形成，因此疏水层析和其他层析法相比更利于复性，并能够在最终实验中获得较高的活性回收率。

2.3 扩张床吸附层析

扩张床吸附层析最早主要是直接从细菌裂解变性液中捕获并复性对应的目标蛋白，将细菌破碎液直接加入到高浓度的变性剂中，然后将其上样到扩张好的柱床上，细胞碎片和不吸附的杂质会流穿掉，而变性蛋白则被吸附在固相上，此后通过逐渐降低变性剂的浓度诱使变性蛋白质折叠复性，将扩张床沉降后使用洗脱缓冲液将目标的蛋白洗脱下来，通过吸附、复性和洗脱，使变性蛋白得到复性，并获得初步的纯化。在此过程中细菌破碎液的清洗、复性和纯化等结合为一体，实现了集成化操作，因此该复性技术的应用前景广阔[4]。

2.4 亲和层析

亲和层析技术，充分运用固定相和目标蛋白质之间的特异性吸附作用，使得目标蛋白质可以在固定相中保留，从而导致变性剂和蛋白质分离，而后在洗脱过程中进行复性，依据亲和层析复性的柱基成分不同，可以将亲和层析复性分为脂质体亲和层析、分子伴侣亲和层析和固定化金属亲和层析等方法；因为配体和目标蛋白质之间的作用特异性强，因此不同配体和蛋白质间的作用差别较大，故而亲和层析复性的整体机理相对较为复杂[5]。

3 结语

包涵体蛋白的纯化层析复性技术众多，本文所阐述的几种方法具有共同之处，即能够通过线性洗脱，在温和的条件下实现复性和层析介质的隔离，降低了蛋白互相作用而产生的聚集，最终能够在耗时较短的情况下实现蛋白的纯化和复性。但是目前蛋白质的折叠和聚集机制尚未被准确做出解释，因此对于不同蛋白质的详细情况还需反复试验证实，最终为临床提供更优的复性方法选择途径。