血小板输注无效患者血小板特异性糖蛋白抗体表达的实验研究

杨　帆,陈　琳,刘铁梅,焦立新△,韩　瑜△,于江虹,陈俊宇,赵本正

(1.长春市中心血站，吉林 长春130033；2.吉林大学中日联谊医院)



△共同通讯作者

血小板输注无效患者血小板特异性糖蛋白抗体表达的实验研究

杨帆1,陈琳1,刘铁梅2,焦立新1△,韩瑜1△,于江虹1,陈俊宇2,赵本正2

(1.长春市中心血站，吉林 长春130033；2.吉林大学中日联谊医院)

摘要：目的探讨血小板输注无效(PTR)患者血小板特异性糖蛋白抗体的表达情况。方法采用ELISA方法检测56名临床上确诊为PTR患者的血小板特异性糖蛋白抗体、应用PCR方法检测其血小板特异性抗原(HPA)1-6，15 基因分型。结果56名PTR患者检出血小板特异性糖蛋白抗体，8例表达阳性(占14.3%)，包括血小板特异性糖蛋白 GPⅡb/Ⅲa 阳性7例，GPⅠa/Ⅱa阳性1例、GPⅠb/Ⅰx阳性1例、GPⅣ阳性1例。结合8例患者的抗体检测反应格局和HPA抗原基因型结果分析抗体的特异性为：4例存在抗-HPA3b、3例存在抗-HPA3a、1例存在抗-HPA5b。结论反复输血的血小板输注无效患者，应选择HPA抗原相匹配的血小板供者，以改善血小板输注效果。

关键词：血小板；HPA；血小板特异性糖蛋白抗体；血小板输注无效

(ChinJLabDiagn,2016,20:0620)

血小板输注无效(PTR) 是指患者经过2次或以上ABO血型相配的血小板输注后，血小板计数与输注前相比，没有达到合适的纠正计数增加率，甚至较输血前下降的现象。引起 PTR 的主要原因：一是同种免疫因素(HLA抗体、血小板特异性糖蛋白相关HPA抗体及红细胞相关抗体)；二是非免疫因素，包括发热、感染、脾肿大等。一般认为由于同种免疫产生抗体是临床血小板输注无效的主要因素[1]。目前对HLA抗体较为重视，但少部分患者血小板输注效果仍旧不能改善。因此，我们对血小板输注无效患者的血小板特异性糖蛋白抗体表达情况进行分析，该实验研究包括患者的HPA抗原系统HPA1-6,15基因分型和血小板特异性糖蛋白抗体的ELISA法检测，进而分析抗体特性。现报道如下。

1材料和方法

1.1研究对象选取 2015年1月-10月因血小板输注无效来我血液中心做血小板配型的患者，共56名(包括男性29名、女性27名)，平均年龄45岁，分别为白血病28例、再生障碍性贫血25 例、骨髓增生异常综合征(MDS)3 例。这些患者输注血小板均2次以上，输注后血小板不升高甚至下降，符合PTR的临床诊断。抽取静脉血5 ml/人，分别置于EDTA抗凝管和干燥试管中，4℃保存。

1.2试剂与仪器PAK-PlUS抗体检测试剂盒(批号：3002286，美国GTI公司)；HPA1-6,15 基因检测试剂盒(批号：201403004，天津秀鹏公司)；DNA提取试剂盒(Lot N2905，德国 QIAGEN公司)；PCR 仪(C1000 Touch型，美国Bio-Rad公司)；凝胶成像分析仪(UVP，JY04S-3C，北京六一仪器)；超微量微孔板分光光度计(Epoch，美国 Bio-Tek 公司)。

1.3PCR法HPA1-6,15基因分型从EDTA抗凝试管中取标本全血500 μl/份，提取DNA，浓度(50-100)ng/μl、纯度1.6-1.8；PCR扩增按照试剂盒说明书操作，配制 Buffer-酶-样本混合液，分别加入每个引物孔，上PCR仪扩增，经变性、退火、延伸，模板DNA与特异性引物结合、扩增，取扩增产物10 μl在2% 琼脂糖凝胶中(含溴化乙锭1 μg/μl)电泳20 min，凝胶成像分析仪观察结果并拍照。

1.4ELISA法检测血小板特异性糖蛋白抗体使用PAK-PlUS ELISA试剂盒检测56名PTR患者，按照说明书操作，加入终止液后用分光光度计在405 nm处读取各孔吸光度，490 nm为参照波长，测定孔吸光度≥2倍阴性孔(cut-off值)即判为阳性结果。反应板A、B孔为血小板特异性糖蛋白GPⅡb/Ⅲa，分别包被了 HPA-1a/1a、3a/3a、-4a/和HPA-1b/1b、3b/3b、-4a；C、D孔为血小板特异性糖蛋白GPⅠa/Ⅱa，分别包被了 HPA-5b/5b、 HPA-5a/5a;E孔为血小板特异性糖蛋白GPⅠb/Ⅰx；F孔为血小板特异性糖蛋白GPⅣ。结合血小板特异性糖蛋白和HPA基因分型结果，可以推断HPA抗体的特异性。

2结果

2.1患者HPA1-6,15基因分型结果患者HPA基因型为HPA-1aa，2aa，3bb，4aa，5aa，6aa，15ab(见图1)。

注：1-14依次为1a、1b、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、5b、6a、6b、15a、15b;M为Marker

图1患者HPA基因分型电泳图

2.2血小板特异性糖蛋白抗体检测结果被检测的56例PTR患者中共8例(占14.3%)有血小板特异性糖蛋白抗体表达，其中抗GPⅡb/Ⅲa 7例、抗GPⅠa/Ⅱa 阳性1例、抗GPⅠb/Ⅰx阳性1例，抗GPⅣ阳性1例。对这8例抗体检测阳性的患者反应格局和HPA抗原基因分型结果进行分析，进而推断患者体内表达的血小板特异性糖蛋白抗体特性，检出4例抗-HPA3b、3例抗-HPA3a、1例抗-HPA5b(具体见表1)。

表1　 8名患者表达的血小板特异性糖蛋白抗体及特性

3讨论

血小板特异性糖蛋白抗体的产生与血小板表面的特异性抗原密切相关，特异性抗原均存在于血小板膜糖蛋白上(GP)，由血小板特有的抗原决定簇组成，表现血小板独特的遗传多态性，是由单一核苷酸改变或一对碱基置换引起个别氨基酸的不同形成的(例如HPA-3a、3b是糖蛋白GPⅡb 的常见多态性，是由第843位氨基酸多态性引起)。反复多次输注血小板可使GP抗原刺激受血者产生同种免疫性抗体，这是免疫性PTR产生的重要原因。血小板输注量和输注次数越多，患者体内免疫相关性血小板抗体的产生概率越高，也越容易导致PTR[2]。

我们对抗体检测阳性的患者反应格局和HPA抗原基因分型结果进行分析，推断出患者体内表达的抗体特性。例如：患者1检测GPⅡb /Ⅲa (+)，HPA 抗原HPA1-6,15均为aa 纯合子，则存在抗-HPA-1b、-3b，但HPA-1b 在本地区不是高频抗原[3]，推断表达抗-HPA3b，选择血小板供者HPA-3aa;患者2的GPⅠa/Ⅱa(+)，且HPA抗原为HPA-5aa，可推断该患者存在抗-HPA5b，选用HPA-5aa 的供者;患者5和7除检测到常见的GPⅡb /Ⅲa外，还分别检出了-GPⅠb/Ⅰx和GPⅣ，因此在供者选择上要求更高，应尽量选择HPA抗原基因型相同的患者(表1)。

不同人群中的HPA抗原的分布频率与获得HPA免疫机会正相关，即HPA抗原a/b对偶不配合的比例越高，产生抗体几率越高[4]，白人中抗HPA-1a抗体最常见，日本人中抗HPA-2b最常见。我们以往的研究数据表明[3]：中国北方地区人群HPA-1-5和15的6个a/b对偶抗原不配合率中HPA-3(0.366)及HPA-15(0.374)系统不配合率最高，其他系统不配合率较低。本实验检出HPA抗体以抗-HPA 3b、3a最多，与HPA-3抗原系统的不配合率相符；但是由于目前检测试剂还不能精确分辨出血小板特异性糖蛋白抗体的所有特异性，因此抗-HPA 15a、15b在患者体内的表达情况还有待今后继续探讨。

通过血小板特异性糖蛋白抗体检测，可在供者选择中尽量避免相对应抗原，减轻免疫性因素对血小板输注效果的影响。本实验研究显示有14.3%的血小板输注无效患者血清中检测到有血小板特异性糖蛋白抗体表达，说明除HLA抗体外，HPA抗原和抗体也是临床输血中值得重视的一项免疫因素，避免输注HPA抗原不匹配的血小板，可以减少血小板输注无效的发生，减少血液资源的浪费。

参考文献：

[1]Marwaha N，Shama RR．Consensus and controvercies in platelet transfusion[J]．Transfus Apher Science，2009，41(2):127.

[2]马印图，李振奇，王全立．血小板抗体检测技术进展[J]．中华检验医学杂志，2006，11(29):1041.

[3]于江虹,杨帆,焦立新,等.长春地区无偿献血者HPA1-6,15 基因分型及频率调查[J].中国实验诊断学，2011,15(4)，680.

[4]Kiefel V，Konig C，Kroll H，et al． Platelet alloantibodies in transfused patients[J]．Transfusion，2001，41(6):766.

Experimental study on expression of anti-platelet glycoprotein specific antibody in the platelet transfusion refractoriness patient

YANGFan,CHENLin,LIUTie-mei,etal.

(ChangchunBloodStation,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the expression of anti-platelet glycoprotein specific antibody in the platelet transfusion refractoriness patients.Methods56 platelet transfusion refractoriness patients were studied.platelet-specific glycoprotein antibody were detected with ELISA.HPA1-6，15 genotypes were detected with PCR.Results56 PTR patients in all,anti-platelet glycoprotein specific antibody in 8 cases were positive.Respectively,7 cases were GPⅡb/Ⅲa antibody positive;1 cases were GPⅠa/Ⅱa antibody positive;1 cases were GPⅠb/Ⅰx antibody positive;1 cases were GPⅣ antibody positive.After analyze platelet glycoprotein specific antibody and patients’ HPA genotypes,there are 4 cases anti-HPA3b,4 cases anti-HPA3a and 1 cases anti-HPA5b.ConclusionAbout these platelet repeated transfusion refractoriness patient,the Donor whose HPA antigen match to patient should be chosen to improve the transfusion effect.

Key words:platelet;HPA;platelet-specific glycoprotein antibody;platelet transfusion refractoriness

(收稿日期：2015-12-30)

中图分类号：R446.62 R331.1+ 43

文献标识码：A

基金项目：吉林省自然科学基金项目(201015186)、吉林省卫生青年科研课题(2013Q016)、吉林省卫生自筹经费课题(2013ZC010)

文章编号：1007-4287(2016)04-0620-03