11β-类固醇脱氢酶-2启动子区甲基化与原发性高血压关系初探

王述琦,刘丽秋,刘海娜

(1.青岛大学附属青岛市市立医院 a干保科;b超声科,山东 青岛266011；2.青岛大学附属医院 肾内科)



11β-类固醇脱氢酶-2启动子区甲基化与原发性高血压关系初探

王述琦1a,刘丽秋2*,刘海娜1b

(1.青岛大学附属青岛市市立医院 a干保科;b超声科,山东 青岛266011；2.青岛大学附属医院 肾内科)

摘要：目的通过11β- 类固醇脱氢酶-2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 ,11β-HSD-2)基因启动子区甲基化发生率的测定,探讨原发性高血压可能的发病机制。方法选取未经治疗的原发性高血压患者64例以及正常对照组30例,Sequenom MassArray质谱法检测11β-HSD-2基因启动子区“-101到461”的563个碱基序列的甲基化发生率。结果原发性高血压组甲基化发生率高且差异有统计学意义,CpG位点如下：CpG_7、8、CpG_9、CpG_62、63、64、CpG_65、CpG_72。t值分别为-5.42,-3.17,-2.84,-2.32和-2.32,P<0.05。CpG_7、8、CpG_9位于核心启动子区。结论原发性高血压患者11β-HSD-2基因启动子区存在高甲基化发生率位点。

关键词：11β-类固醇脱氢酶-2;原发性高血压;启动子区;甲基化

(ChinJLabDiagn,2016,20:0570)

我国大约有2亿高血压患者,且发病率逐年上升[1,2]。近年来研究[3-6]发现DNA甲基化修饰与高血压发病密切相关。已有研究证实11β- 类固醇脱氢酶-2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2,11β-HSD-2)[7]参与高血压的发病[8,9]。高血压患者11β-HSD-2基因启动子区甲基化发生率的测定国内未见报道。本研究探讨11β-HSD-2基因启动子区甲基化与原发性高血压的关系。

1资料与方法

1.1研究对象收集64例未经药物治疗的原发性高血压(符合JNCVⅡ及欧洲高血压指南)患者作为观察组,其中男52例,女12例,平均年龄(46.5±9.4)岁。30例健康查体者作为正常对照组,其中男24例,女6例,平均年龄(44.4±8.2)岁。排除标准：所有观察者均已排除正在使用降压药物者、继发性高血压、肾功能不全、肝硬化、甲状腺功能亢进、糖尿病、冠心病、心脏瓣膜病、肿瘤、自体免疫病、过量饮酒及其它慢性疾病。2组患者一般资料及体质量指数具有可比性,差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2检测项目生化全套、甲功及血、尿常规、心电图、胸X线片,测定11β-HSD-2基因启动子区甲基化发生率测定。

1.3主要实验仪器DYY-Ⅲ型电泳槽(北京市六一仪器厂),FD201 稳压稳流电泳仪(北京通用分析仪器厂),Tanon-3500 全自动数码凝胶成像系统(上海天能科技有限公司),全波长紫外/可见光扫描分光光度计NanoDrop-2000(美国 NanoDrop公司),DNA浓缩仪(Eppendorf,Concentractor5301),K960热循环仪(杭州晶格科学仪器有限公司), MassARRAY系统(Sequenom公司),TF-0384型384孔PCR板(ABGene公司), Veriti 384 well PCR仪(AB公司)。

1.4实验试剂及耗材PureGene DNA抽提试剂盒EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO), 样本亚硫酸盐处理用试剂盒 EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO),一套 10 μM 扩增引物(上海赛百胜基因技术有限公司合成),25 mM dNTP 混合物(Sequenom 公司),5 U/μL 热启动 Taq 酶(Sequenom 公司),SAP 缓冲液(Sequenom 公司),SAP 酶(1.7 U/μL) (Sequenom 公司),T Cleavage Mix(Sequenom 公司),100 mM DTT(Sequenom 公司),T7 RNA & DNA Polymerase(Sequenom 公司),RNase A(Sequenom 公司),Lambda DNA/EcoRI+HindⅢ(大连宝生物工程公司),溴酚蓝(上海生工生物工程公司),琼脂糖(Agarose),(上海生工生物工程公司)。

1.5引物设计和合成引物信息：5’端引物序列：aggaagagagGGGAGAGAAGTGAAGGAAAGTT,3’端引物序列 :cagtaatacgactcactatagggagaaggctTCAATCCTATTAAATATCCAATCCC。查询并确定待测的基因序列,将目的序列输入到EpiDesigner软件进行引物设计。将目的序列粘贴到PasteSequence中,根据软件运算结果,选择并确定合适的引物方案,合成引物,每条50D。由华大基因科技有限公司完成。

1.6外周血DNA的提取抽取高血压患者和正常对照组观察者清晨空腹静脉血3 ml,按照PureGene DNA抽提试剂盒说明书方法提取外周血DNA。

1.7Sequenom MassARRAY甲基化检测11β-HSD-2基因启动子区甲基化发生率。由华大基因科技有限公司完成。

1.8统计学方法所有数据均采用SPSS18.0统计软件包统计。将甲基化发生率做对数转换使之成正态分布,对每一个检测位点分别做高血压组和正常对照组的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

入选94例(原发性高血压患者64例,正常观察者30例),检测11β-HSD-2基因启动子区 “-101到461”的一段包含563个碱基序列的基因片段,其中核心启动子位于距转录起始位点“-52到7”的碱基序列,其中包含CpG_7、8、9三个甲基化位点。甲基化发生有显著性差异的CpG位点如下：CpG_7、8 位于“-20到-14”的位置(t=-5.42,P<0.05)。

CpG_9 位于“-8到-9”的位置(t=-3.17,P<0.05)。CpG_62、63、64位于“373到378”的位置(t=-2.84,P<0.05)。CpG_65位于“390到391”的位置(t=-2.32,P<0.05)。CpG_72位于“430到431”的位置(t=-2.32,P<0.05)。凝胶电泳结果分别如下图1。

图1　凝胶电泳结果

3讨论

近年来DNA甲基化在心血管领域的研究渐成为焦点并受到学者们的关注,甲基化是指在DNA甲基转移酶介导下,在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一个甲基集团,变成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化学修饰过程。DNA 甲基化主要发生在基因的启动子区和第一个外显子区的CpG 岛,启动子区CpG发生甲基化改变了基因的表观遗传性状,基因的活性发生了变化,进而影响细胞分化、基因调控、X 染色体失活等诸多过程[5,6]。甲基化与高血压发病相关[10,11],因此了解DNA甲基化的调控机制对于原发性高血压的预防、控制和临床合理用药具有重要意义。

近年来研究证据显示,代谢酶11β-HSD-2活性降低,游离皮质醇水平升高可导致高血压[12]。11β-HSD-2基因通过发生甲基化调控,影响11β-HSD-2的表达和活性,从而通过肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活,以及肾性水钠潴留等途径引起高血压的发生[13]。

国外Alikhani-Koopaei 等[14]的研究证实,11β-HSD-2 基因启动子及第一外显子区的CpG 岛发生甲基化会导致基因转录活性下降,引起11β-HSD-2 表达降低,进而使血压升高。体外培养人类细胞和对大鼠进行的体内实验证实,给予DNA 甲基化酶抑制剂5- 氮杂胞苷及普鲁卡因胺后,11β-HSD-2基因转录水平提高,进而表达增加,提示成年个体DNA 甲基化水平的改变与高血压的发病密切相关。Friso 等[15]对原发性高血压患者和部分继发性高血压患者的研究,发现人外周血单核细胞上的11β-HSD-2 基因启动子区甲基化水平与基因表达水平呈负相关,11β-HSD-2 基因启动子区甲基化程度增高,11β-HSD-2 基因表达下降,血压升高,提示11β-HSD-2 基因启动子区甲基化水平与血压水平呈正相关。Wyrwoll 等[16]对孕妇的研究发现,孕妇服用地塞米松会降低子代肾脏11β-HSD-2 的表达,导致血压升高。Burns 等[17]对这种机制的研究认为,子代胚胎植入子宫的过程中绝大多数基因会发生去甲基化反应,而由于母体子宫内环境不同引起去甲基化水平的差异,导致基因表达的差异。以上研究证实,11β-HSD-2 基因启动子区甲基化的发生与高血压发病密切相关。

总之研究认为,高血压患者11β-HSD-2 基因启动子区甲基化程度增高致11β-HSD-2基因表达下降,11β-HSD-2酶活性降低,进而血压升高。11β-HSD-2酶活性与高血压的关系国内研究[18-20]较为一致的观点是11β-HSD-2酶活性下降,血压升高。但高血压患者11β-HSD-2 基因启动子区甲基化程度的研究国内未见报道。

本研究共筛选未治疗的原发性高血压患者64例,正常对照组30例,共检测11β-HSD-2 基因启动子区-101至461区域内563个核苷酸序列的甲基化位点27个,其中甲基化发生率明显高于正常对照组的位点是CpG_7、8(位于-20到-14)、CpG_9(位于-8到-9)、CpG_62、63、64(位于373-378)、CpG_65(位于390到391)和CpG_72(位于430到431),其中CpG_7、8、9位点位于核心启动子区。Sequenom MassArray时间飞行质谱生物芯片系统用于甲基化定量分析研究,是目前唯一采用质谱法进行直接检测的设备。质谱法甲基化检测具有很高的灵敏度和稳定性,可定量分析DNA甲基化发生率,尤其适合临床上容易获取、但DNA含量低的血浆标本。关于原发性高血压患者11β-HSD-2 基因启动子区甲基化发生率的研究国内未见报道,采用质谱法甲基化检测,初步证实原发性高血压患者11β-HSD-2 基因启动子区存在有统计学意义的高甲基化CpG位点,包括位于核心启动区的CpG_7、8、CpG_9以及位于启动子区的CpG_62、63、64、CpG_65和CpG_72。由于实验经验不足、时间、经费限制本研究例数相对较少。原发性高血压患者11β-HSD-2 基因启动子区甲基化状况还有待于进一步扩大样本量观察。另外可进一步观察11β-HSD-2 基因启动子区甲基化发生率与肾素-血管紧张素-醛固酮的相关性,从而更进一步阐明11β-HSD-2基因甲基化参与高血压发病的机制。

参考文献：

[1]中国高血压防治指南修订委员会.中国高血压防治指南 2010[J].中华心血管病杂志,2011,39:707.

[2]Kelly TN,Gu DF,Chen J,et al.Hypertension subtype and risk of cardiovascular disease in Chinese adults[J].Circulation,2008,118:1558.

[3]谭双香,李君,易红,等.基因甲基化导致鼻咽癌组织14-3-3σ 表达下调[J].生物化学与生物物理进展,2009,36:743.

[4]McCabe M T,Brandes J C,Vertino P M.Cancer DNA methylation:molecular mechanisms and clinical implications[J].Clin Cancer Res,2009,15:3927.

[5]Cotton A M,Avila L,Penaherrera M S,et al.Inactive X chromosome-specific reduction in placental DNA methylation[J].Hum Mol Genet,2009,18:3544.

[6]Deng T,Kuang Y,Zhang D,et al.Disruption of imprinting and aberrant embryo development in completely inbred embryonic stem cell-derive mice[J].Dev Growth Differ,2007,49:603.

[7]Mariniello B,Ronconi V,Sardu C,et al.Analysis of the 11b-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 gene (HSD11B2) in human essential hypertension[J].Am J Hypertens,2005,18:1091.

[8]张继业.表观遗传与高血压[J].心脑血管病防治,2013,4：88.

[9]Satoh M,Kikuya M,Hara A,et al.Aldosterone-to-renin ratio and home blood pressure in subjects with higher and lower sodium intake：the Ohasama study[J].Hypertens Res,2011,34:361.

[10]杜霞,袁洪,邢晓为.DNA甲基化与原发性高血压的研究进展[J].生物化学与生物物理进展,2010,37：364.

[11]Cowley AW,Nadeaa JH.Baccareli A,et al .Report of the National Heart,Lung and Blood Institute Working Group on Epigenetics and Hypertension[J] .Hypertension,2012,59:899.

[12]Ferrari P.The role of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 in human hypertension[J].Biochim Biophys Acta,2010,1802:1178.

[13]Draper N,Stewart P M.11-hydroxysteroid dehydrogenase and the pre-receptor regulation of corticosteroid hormone action[J].J Endocrinol,2005,186(2):251.

[14]Alikhani-Koopaei R,Fouladkou F,Frey F J,et al.Epigenetic regulation of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 expression[J].Clin Invest,2004,114:1146.

[15]Friso S,Pizzolo F,Choi S W,et al.Epigenetic control of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase 2 gene promoter is related to human hypertension[J].Atherosclerosis,2008,199:323.

[16]Wyrwoll C S,Mark P J,Waddell B J.Developmental programming of renal glucocorticoid sensitivity and the renin-angiotensin system[J].Hypertension,2007,50:579.

[17]Burns S P,Desai M,Cohen R D,et al.Gluconeogenesis,glucose handling,and structural changes in livers of the adult offspring of rats partially deprived of protein during pregnancy and lactation[J].J Clin Invest,1997,100:1768.

[18]姚兵,张银娣,蔡卫民,等.84例原发性高血压患者和健康志愿者肾11β-HSD活性的测定和比较[J].中国临床药理学杂志,2000,16:332.

[19]蒋文龙,陈清枝,李东野,等,原发性高血压患者肾脏中11β-羟类固醇脱氢酶活性的变化[J].徐州医学院学报,2004,24：394.

[20]张林,康学军,孙子林,等.11β-羟基类固醇脱氢酶2与原发性高血压关系的探讨[J].中国老年医学杂志,2008,28：776.

Methylation rate detection of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 promoter in primary hypertension patients

WANGShu-qi,LIULi-qiu,LIUHai-na.

(Departmentofspecialhealthcare,QingdaoUniversityAffiliatedQingdaoMunicipalHospital,Qingdao266011,China)

Abstract:ObjectiveBy detecting the methylation rate of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 promoter in patients suffering from primary hypertension,to investigate the mechanism of primary hypertension.MethodsTo select 64 cases of untreated patients suffering from primary hypertension and 30 healthy persons as controls.The CpG islands of 11β-HSD-2 gene promoter include 563 bases from “-101 to 461”.To detect its methylation rate using Sequenom MassArray method.ResultsThe methylation rates are higher at CpG_7、8、CpG_9、CpG_62、63、64、CpG_65 and CpG_72 in patients suffering from primary hypertension,and the differences are significant,t=-5.42,-3.17,-2.84,-2.32 and -2.32,P<0.05.CpG_7、8 and CpG_9 are in the core promoter sequence.ConclusionPatients suffering from primary hypertension have hypermethylation frequency sites in the promoter region of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 gene as compared to the control group.

Key words:11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2；Primary hypertension；Promoter；Methylation

(收稿日期：2015-10-16)

中图分类号：R541.3

文献标识码：A

*通讯作者

文章编号：1007-4287(2016)04-0570-04