血清M30抗原水平对HBV相关慢加急性肝衰竭的预后评估价值

陈榕　曹竹君　王云　项晓刚　安宝燕　谢青　王晖　郭清

200025　上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科



·论著·

血清M30抗原水平对HBV相关慢加急性肝衰竭的预后评估价值

陈榕曹竹君王云项晓刚安宝燕谢青王晖郭清

200025上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科

【摘要】目的探索HBV感染后不同疾病阶段的肝细胞凋亡水平及其对HBV相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)预后的评估价值。方法前瞻性纳入40例慢性乙型肝炎(CHB)、40例乙型肝炎肝硬化(HBV-LC)以及54例HBV-ACLF患者，同时设立40例健康对照(HC)。针对HBV-ACLF患者随访3个月，根据随访结果分为存活组及死亡组。检测所有研究对象血清角蛋白18凋亡特异性裂解片段M30抗原水平作为反映肝细胞凋亡水平的间接指标。结果CHB、HBV-LC及HBV-ACLF组血清M30抗原水平分别为145.24(IQR 86.31，206.39)U/L，213.42(IQR 147.30，391.28)U/L及762.67(IQR 492.45，1395.24)U/L，均显著高于HC组[60.34(IQR 50.58，67.64)U/L](P<0.01)。随着疾病严重程度升高，血清M30抗原呈现递增趋势，尤以HBV-ACLF组最高，显著高于CHB(P<0.01)及HBV-LC组(P<0.01)。M30抗原与ALT、AST、TBil、PT、INR以及HBV DNA呈显著正相关(均P<0.01)，与Alb呈显著负相关(P<0.01)。HBV-ACLF 随访3个月死亡组患者血清M30抗原水平[1175.18(IQR 756.57，3224.94)U/L]显著高于存活组患者[491.39(IQR 264.23，657.17)U/L](P<0.01)。血清M30抗原能够良好地预测HBV-ACLF患者3个月预后情况，曲线下面积为0.86(95% CI 0.75～0.96，P<0.01)。结论肝细胞凋亡水平与HBV感染后的疾病严重程度密切相关，血清M30抗原可能成为HBV相关慢加急性肝衰竭早期预后的候选指标。

【关键词】慢加急性肝衰竭；乙型肝炎病毒；细胞凋亡；预后

乙型肝炎的重症化演变是乙型肝炎相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)最终发生的原因所在，是一个累及多因素、多器官、多阶段的复杂过程，其中肝细胞的大量死亡是HBV-ACLF发展过程的核心事件，贯穿整个疾病进程[1]。越来越多的研究表明，肝细胞凋亡在慢加急性肝衰竭疾病进展过程中扮演重要角色，但其具体作用尚不明确。角蛋白18(Keratin-18, K-18)是肝细胞最主要的中间纤维蛋白，作为骨架结构支撑并维持肝实质细胞正常的形态[2]。肝细胞凋亡过程中，K-18经由凋亡蛋白酶家族一系列CASPASE蛋白切割后，形成拥有凋亡特异性抗原点位的裂解片段(M30抗原)并释放入循环血，循环血M30抗原的水平可反映肝细胞凋亡水平[3]。本研究旨在探讨HBV-ACLF患者的循环血肝细胞凋亡水平特点及其临床意义。

资料和方法

一、病例来源

研究对象为瑞金医院2013年2月至2014年8月就诊的134例患者，男性109例，女性25例，年龄19～70岁，平均年龄为(45.6±1.0)岁。其中CHB患者40例，HBV-LC患者40例，HBV-ACLF患者54例。同时纳入健康志愿者40名作为健康对照。CHB诊断标准参考2010年慢性乙型肝炎防治指南[4]，HBV-ACLF诊断标准参考2009年亚太肝病学会慢加急性肝衰竭(ACLF)共识[5]。排除合并HCV、HDV、HEV或HIV感染、明确的脂肪性肝病、威尔森氏症、自身免疫性肝病及酒精性肝病等。

二、方法

1. 血清样本及临床数据采集：入组HBV-ACLF患者血清均为入院当日留取，CHB患者、HBV-LC及健康志愿者在入组当日采集血清。所有血清样本于-20 ℃冻存备用。对应录入所有入组对象基线人口学、外周血生物化学指标、血常规、凝血功能、病毒学指标以及影像学检查结果等。

2. 血清M30抗原的测定：血清M30抗原定量采用酶联免疫吸附试验的方法，试剂盒为M30-Apoptosenses ELISA kit (PEVIVA AB, Bromma, Sweden)。所有操作严格按照说明书进行。

3. 肝衰竭患者预后评估：计算CTP评分[6]、MELD评分[7]及MELD-NA评分[8]。

三、统计学处理

统计分析采用SAS 9.0及Sigmaplot 12.5软件。血清M30抗原水平以中位数(上下四分位数)表示，其余计量资料以均数±标准误表示。正态分布的计量资料组间比较采用t检验；非正态分布的计量资料组间比较采用曼惠特尼U检验；计数资料采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关检验。各类指标对HBV-ACLF患者的短期预后评估的诊断效能用受试者工作特征曲线下面积(ROC)来评价。双侧P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、研究对象基本资料

本研究共纳入134例患者及40例健康志愿者，患者分3组，分别为CHB、HBV-LC以及HBV-ACLF组。所有研究对象入组时各指标检测结果见表1。54例HBV-ACLF患者随访3个月后，存活22例，死亡32例。

二、各组血清M30抗原水平

健康对照组血清M30抗原水平为60.34 U/L(50.58 U/L, 67.64 U/L)，显著低于患者组水平302.52 U/L(151.07 U/L, 695.62 U/L；P<0.01)。见图1A。患者组中，随着疾病严重程度升高，血清M30抗原呈现递增趋势，尤以HBV-ACLF组最高，各组间差异有统计学意义(P<0.01)。见图1B。

三、患者血清M30抗原与肝功能评估指标及病毒载量的相关性

患者血清M30抗原与肝功能指标(ALT、AST、GGT、TBil、Alb)、凝血功能指标(PT、INR)以及病毒载量HBV DNA的相关性见表2。

四、基线血清M30抗原水平在HBV-ACLF患者中的预后价值

随访3个月死亡组基线M30抗原水平明显高于存活组，见图2A。ROC曲线结果显示，血清M30抗原水平具有预测HBV-ACLF患者短期预后的能力，且AUC大于传统的肝衰竭预后评估模型CTP评分、MELD评分以及MELD-NA评分，但差异无统计学意义，见图2B。血清M30抗原Cut-off值定为>750.47 U/L时，预判HBV-ACLF患者死亡的灵敏度和特异度最好，特异度为86.36%，灵敏度为78.13%，阴性预测值为73.08%，阳性预测值为89.29%。

表1　各组患者基线特征

注：1A. 血清M30抗原在患者组水平明显高于健康人群。1B. 血清M30抗原水平在疾病组中随着疾病严重程度进行性升高，在HBV-ACLF患者组水平最高，显著高于CHB及HBV-LC组

图1血清M30抗原水平在健康人群及患者中的水平

注：2A为存活组与死亡组患者M30抗原水平比较；2B为血清M30与其他肝衰竭预后评估模型的ROC曲线

变量相关系数P值ALT0.53<0.01AST0.72<0.01GGT0.160.06TBil0.69<0.01Alb-0.42<0.01PT0.64<0.01INR0.64<0.01HBVDNA0.270.002

讨论

HBV-ACLF病程进展较快，目前治疗措施有限，疗效不能令人满意，病死率仍较高，严重威胁我国人民的生命健康。根据HBV-ACLF内在的机制特点，建立行之有效的病情评价及预后评估体系，继而指导临床治疗决策是降低病死率的关键所在。目前国内尚无针对HBV-ACLF的预后评估系统，临床主要以传统的终末期肝病模型MELD及CTP评分作为替代，对HBV-ACLF患者进行早期预后评估，同时针对病情制定不同治疗策略。然而由于各评分系统都存在着各自的不足，直接将其应用于HBV-ACLF仍有一些问题存在[9]。国外Jalan等[10]针对ACLF构建的CLIF-C ACLF评分在预测ACLF患者短期及长期预后方面的准确率明显高于传统的MELD评分、MELD-NA评分以及CTP评分，但其研究对象以酒精性肝硬化导致的ACLF为主。虽然不同病因导致的ACLF主要临床特点类似，但这一系统能否直接应用到我国HBV-ACLF群体仍需多中心研究的验证。

本研究通过检测血清中K-18凋亡特异性裂解片段M30抗原的表达情况，以探究肝细胞凋亡水平在HBV-ACLF患者中的特点。同时对比分析其水平在健康人群、慢性乙型肝炎以及乙型肝炎肝硬化患者中的差异，结果发现血清M30抗原水平在HBV-ACLF患者中显著高于健康人群以及其他疾病阶段的患者，并与ALT、AST、TBil、PT、INR、HBV DNA等呈正相关性，与白蛋白呈负相关性，表明升高的M30抗原与病情程度紧密相关。此外，血清M30抗原水平能够有效区分HBV-ACLF存活组和死亡组患者，死亡组患者的M30抗原水平显著高于存活组患者。ROC曲线分析表明血清M30抗原对HBV-ACLF患者3个月预后具有良好的评估作用，曲线下面积达0.86，大于传统的CTP、MELD以及MELD-NA评分，但差异无统计学意义。这表明血清M30抗原水平在一定程度上能够评价病情严重程度以及评估疾病预后情况。目前，少有研究针对性分析HBV-ACLF病程中特定肝细胞死亡模式，比如肝细胞凋亡、坏死甚至是凋亡性坏死的作用。慢性HBV感染所引起持续的宿主免疫损伤、肝内微循环障碍以及肠源性内毒素血症等均可造成大量肝细胞死亡[11]。死亡肝细胞及其释放的细胞内容物作为炎性刺激因子，上调各类促炎因子促使原本较为稳定的慢性乙型肝炎、肝硬化状态暴发急性肝功能失代偿进而发展为肝衰竭[5]。

本研究进一步阐明了HBV-ACLF患者血清肝细胞凋亡水平在反映病情严重程度以及预后评估方面的重要作用。但尚不能得出HBV-ACLF患者中显著升高的肝细胞凋亡水平对疾病本身的作用，今后将进一步针对HBV-ACLF开展动态研究，以期探讨高水平的肝细胞凋亡在HBV-ACLF疾病进展中的作用，并同时建立多中心、前瞻性、大样本量临床队列验证血清M30抗原作为HBV-ACLF病情及预后评价指标的作用。

参考文献

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10Jalan R, Saliba F, Pavesi M, et al. Development and validation of a prognostic score to predict mortality in patients with acute-on-chronic liver failure. J Hepatol, 2014, 61: 1038ú1047.

11Jalan R, Yurdaydin C, Bajaj JS, et al. Toward an improved definition of acute-on-chronic liver failure. Gastroenterology, 2014, 147:4-10.

(本文编辑：钱燕)

The prognostic value of serum M30-antigen levels in patients with HBV-related acute-on-chronic liver failureCHENRong,CAOZhu-jun,WANGYun,XIANGXiao-gang,ANBao-yan,XIEQing,WANGHui,GUOQing.DepartmentofInfectiousDiseases,RuijinHospital,Shanghai200025,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the apoptotic level of hepatocytes in patients with chronic hepatitis B virus (HBV) infection at different stages, and to evaluate its prognostic value on HBV-related acute-on-chronic liver failure (HBV-ACLF). MethodsA prospective study was carried out in 174 patients including 40 chronic hepatitis B (CHB), 40 HBV-related liver cirrhosis (HBV-LC), 54 HBV-ACLF patients and 40 healthy controls (HC). HBV-ACLF group were followed up for 3 months and classified into survival and death group. Apoptotic levels of hepatocytes were measured by detecting keratin-18 associated caspase-cleaved fragment, M30-antigen. ResultsSerum M30-antigen levels in CHB, HBV-LC and HBV-ACLF were 145.24 [interquartile range (IQR 86.31-206.39) U/L, 213.42 (IQR 147.30-391.28) U/L and 762.67 (IQR 492.45-1395.24) U/L respectively, which were significantly (P<0.01) higher than those in HC group [60.34 (IQR 50.58-67.64)U/L]. Moreover, serum M30-antigen levels were gradually elevated as disease severity increased, reaching to peek in HBV-ACLF group, which was significantly higher (P<0.01) than those in CHB and HBV-LC group. M30-antigen level was significantly positively correlated with alanine aminotransferase (ALT), aspartate transaminase (AST), total bilirubin (TBil), prothrombin time (PT), international normalized ratio (INR) and HBV-DNA (all P<0.01), while reversely correlated with albumin (P<0.01). More importantly, serum levels of M30-antigen in the death group [1175.18 (IQR 756.57-3224.94) U/L] were significantly (P<0.01) higher than those in the survival group [491.39 (IQR 264.23-657.17) U/L]. Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis demonstrated that serum M30-antigen could well predict 3-month outcome of HBV-ACLF patients, as the area under the curve (AUROC) was 0.86 (95% CI 0.75-0.96, P<0.01). ConclusionHepatocyte apoptosis is closely associated with the disease severity of chronic HBV infection and markedly elevated in patients with HBV-ACLF. Hepatocytes apoptosis biomarker, M30-antigen, might be a potential indicator for the early prognosis of HBV-ACLF.

【Key words】Acute-on-chronic liver failure; Hepatitis B virus; Apoptosis; Prognosis

(收稿日期：2015-11-05)

Corresponding author:GUO Qing，Email：13901922856@163.com

通信作者：郭清，Email：13901922856@163.com

基金项目：国家自然科学基金(81570560)；“十二五”重大专项资助项目(2012ZX10005004-002)；上海市科学技术委员会科技支撑项目(13401902903)；上海市卫生和计划生育委员会重点项目(20134004)；国家临床重点专科建设项目(2012ZX09303-001-001)；苏州市医疗器械与新药专项(ZXY2013003)