经肝固有动脉自体骨髓间充质干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的疗效及安全性

郑盛　杨涓　刘琼　楼维新

650011　云南省第三人民医院肝病中心(郑盛，杨涓)；解放军第五三三医院肝病科(刘琼，楼维新)



·论著·

经肝固有动脉自体骨髓间充质干细胞移植治疗失代偿期肝硬化的疗效及安全性

郑盛杨涓刘琼楼维新

650011云南省第三人民医院肝病中心(郑盛，杨涓)；解放军第五三三医院肝病科(刘琼，楼维新)

【摘要】目的观察经肝固有动脉行自体骨髓间充质干细胞(BMSC)移植治疗失代偿期肝硬化的疗效及其安全性。方法将2012年6至2013年6月解放军第五三三医院肝病科收治的84例失代偿期患者随机分为移植组36例和对照组48例。对照组予以基础治疗(护肝、降黄、对症和支持治疗)，移植组在基础治疗上行经肝固有动脉注入自体BMSC治疗。观察两组丙氨酸氨基转移酶(ALT)、白蛋白(Alb)、总胆红素(TBil)、凝血酶原时间(PT)、终末期肝病模型评分(MELD)的变化情况，分别在4、12、24、48周进行随访；两组肝功能指标比较用独立t检验，治疗后不同时间各肝功能指标的比较用F检验及LSD两两检验，两组之间肝癌发生率和病死率比较应用四格表χ2检验。结果治疗4周后，移植组腹水消退15例(41.7%)，腹胀减轻21例(58.3%)，下肢水肿减轻13例(36.1%)，对照组分别为15例(31.3%)、20例(41.7%)和11例(22.9%)，差异有统计学意义(χ2=8.341、12.689、9.837，P均<0.05)。移植组治疗前及治疗后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil、PT和MELD评分，差异有统计学意义(F=6.172、9.795、10.961、11.198、19.652，P均=0.000)；对照组治疗前及治疗后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil差异有统计学意义(F=5.594、13.664、12.612，P均=0.000)，而PT和MELD评分，差异无统计学意义(F=1.698、2.652，P均>0.05)。移植组与对照组相比，治疗后第4周ALT、Alb、TBil、PT差异有统计学意义(t=3.394、11.625、8.847、15.781，P均<0.05)，MELD差异无统计学意义(t=1.727，P>0.05)；治疗后第48周，ALT、Alb、TBil、PT、MELD差异有统计学意义(t=5.477、8.830、6.371、11.362、9.426，P均<0.05)。随访至第48周，移植组与对照组病死率及肝癌发生率均差异无统计学意义(χ2=4.815、6.286，P均>0.05)。全部患者在移植术中，移植术后近期未发生严重并发症。结论经肝固有动脉自体BMSC移植治疗失代偿期肝硬化是一种安全、有效的方法，可作为肝移植治疗的过渡或补充治疗。

【关键词】肝硬化；骨髓间充质干细胞；移植，自体；肝动脉；治疗

肝硬化是我国常见疾病和主要的死亡原因之一[1]。各种原因导致的肝硬化可进一步发展至肝功能衰竭。肝移植已被证实是各种原因造成的肝功能衰竭最有效的治疗方法，但由于供肝源有限、移植后的免疫排斥反应以及高额的治疗费用使得肝移植的广泛应用受到限制[2]。干细胞具有自我更新和分化能力，在特定条件下，它可分化为不同的功能细胞，形成多种组织和器官[3]。近年来，越来越多的研究证实骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC)在一定的微环境中，可向肝细胞或胆管细胞分化，有助于改善肝硬化患者的肝功能，从而进一步改善肝硬化患者的临床症状[4]。本研究采用经肝固有动脉行自体BMSC移植治疗失代偿期肝硬化，以评价其疗效和安全性。

资料和方法

一、研究对象

2012年6至2013年6月在解放军第五三三医院肝病科住院的失代偿期肝硬化患者84例，其中男51例，女33例，年龄40～68岁，平均年龄(56.5±4.6)岁。所有入选患者肝硬化诊断标准参照《中国肝病诊疗管理规范》白皮书[5]，其中乙型肝炎肝硬化37例，丙型肝炎肝硬化12例，酒精性肝硬化18例，混合性肝硬化(乙型肝炎/丙型肝炎+酒精性肝硬化)14例，血吸虫性肝硬化3例。肝功能分级Child-Pugh B 级54例，Child-Pugh C 级30例。所有患者术前存在不同程度乏力、纳差、腹胀、胸水、腹水、下肢水肿、脾大等症状和体征，均经过影像学检查(包括腹部B 超、CT或MRI)及各项检验，明确诊断为肝硬化。排除标准为有肝脏及其他脏器肿瘤、严重的心肺疾病、肝肾综合征、肝性脑病、近1年接受过干扰素或糖皮质激素治疗者。所有患者入院后均给予对症、支持治疗。所有措施都在患者知情同意下进行，并签署相关知情同意书；该研究经过解放军第五三三医院医学伦理委员会批准。

二、治疗方法

(一)对照组对照组患者给予还原型谷胱甘肽、多烯磷脂酰胆碱、门冬氨酸钾镁和维生素C等加入液体中静脉滴注，1次/d；同时限钠、限水和利尿，未给予输注白蛋白治疗。

(二)移植组在对照组基础治疗的同时，给予经肝固有动脉自体BMSC移植治疗。进入手术室后，患者取平卧位，选取两侧髂后上棘部位为骨髓穿刺点，常规消毒后铺巾，在穿刺点部位以2%利多卡因进行局部浸润麻醉，直至骨膜处，然后使用18号骨髓穿刺针垂直穿刺，进入骨髓腔后予以固定，抽出骨髓。两侧穿刺点共抽取患者骨髓血200 mL，予以7500单位的肝素钠进行抗凝，然后在实验室利用密度离心方法进行骨髓干细胞的体外分离及纯化，使用流式细胞仪检测表面抗原标记为CD34-、CD45-且CD29+、CD44+、CD90+的浓缩的单核细胞，在移植组中采集的间充质干细胞均达到1.0×106/kg体质量，在4℃的保存条件下送至介入室。在数字减影血管造影机下，采用Seldinger技术，局麻下穿刺右侧股动脉，置入5F动脉鞘，引入5F R-H肝动脉导管，置于肝固有动脉，造影了解血管分布，进一步确定无肿瘤样异常血管团，然后将分离好的BMSC悬液缓慢注入肝内。术后拔出动脉鞘，加压包扎穿刺部位，平卧24 h，常规对症处理。

(三)疗效观察术后观察指标包括患者临床症状、体征、实验室指标及影像学检查。术后4、12、24和48周分别复查ALT、Alb、TBil、PT等指标，并进行MELD评分，术后12周复查肝脏超声检查或CT。根据临床症状、体征和实验室检查结果，分为：有效(临床症状有1项以上减轻，体征有1项以上改善，实验室检查指标2项以上好转)，无效(临床症状和体征没有改善，实验室检查指标无好转)。

三、统计学处理

结果

一、基线特征比较

对两组肝硬化患者的年龄、性别、生化学指标及MELD评分方面进行比较，结果两组患者基线特征基本一致，见表1。

二、症状和体征改善情况

治疗4周后，移植组腹水消退15例(41.7%)，腹胀减轻21例(58.3%)，下肢水肿减轻13例(36.1%)，对照组分别为15例(31.3%)和20例(41.7%)，11例(22.9%)，差异具有统计学意义(χ2=8.341、12.689、9.837，P均<0.05)。

三、生化学指标及MELD评分

移植组治疗前及治疗后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil、PT和MELD评分，差异有统计学意义(F=6.172、9.795、10.961、11.198、19.652，P均=0.000)，见表2；对照组治疗前及治疗后4、12、24、48周，ALT、Alb、TBil差异有统计学意义(F=5.594、13.664、12.612，P均=0.000)，而PT和MELD差异无统计学意义(F=1.698、2.652，P均>0.05)，见表3。

移植组与对照组相比，治疗后第4周ALT、Alb、TBil、PT差异有统计学意义(t=3.394、11.625、8.847、15.781，P均<0.05)，MELD差异无统计学意义(t=1.727，P>0.05)，见表4；治疗后第48周，ALT、Alb、TBil、PT、MELD差异有统计学意义(t=5.477、8.830、6.371、11.362、9.426，P均<0.05)，见表5。

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注：与移植前比较，aP<0.05

注：与移植前比较，aP<0.05

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四、随访情况

至48周移植组共死亡6例，2例死于上消化道出血，2例死于肝功能衰竭，1例死于肝性脑病，1例死于肝癌；对照组共死亡10例，3例死于肝功能衰竭，3例死于上消化道出血，2例死于肝性脑病，1例死于继发感染，1例死于肝癌。两组病死率分别为16.7%和20.8%(χ2=4.815，P>0.05)。移植组1例(2.78%)和对照组1例(2.08%)发生肝细胞癌(χ2=6.286，P>0.05)。

五、不良反应

36例自体BMSC移植的肝硬化患者中，除1例患者出现低热及轻微骨痛以外，余患者未发现其他明显不良反应及并发症。

讨论

干细胞是人体内最原始的细胞，是一种具有多分化潜能和自我复制功能的未分化细胞，大量研究证明干细胞不仅可分化为中胚层细胞，还分化为内胚层及外胚层细胞，表明干细胞可以跨系、跨胚层分化，具有强大的可塑性[6]。同时，干细胞具有化学趋向性[7]。根据干细胞的这些特性，临床可用于治疗各种细胞或组织损伤性疾病，如肺纤维化[8]、糖尿病足[9]、溃疡性结肠炎[10]等。目前，临床上用于治疗肝硬化的干细胞，主要包括外周血干细胞、自体骨髓干细胞和脐血干细胞[11]。

国外学者[12]报道，自体BMSC移植可促进受损肝脏的功能恢复和再生，能改善血清胆红素、Alb、凝血国际标准化比值、生活质量、Child-Pugh评分及MELD评分，治疗后未见不良反应。Piscaglia等[13]研究结果显示G-CSF可促进BMSC迁移到肝脏，同时增强内源性肝细胞，即卵圆细胞修复肝脏。Han等[14]报道，PBSC移植治疗失代偿期肝硬化20例，可以改善肝脏的合成功能。上述研究均提示自体BMSC移植治疗肝脏疾病有效。本研究结果与上述研究结果相似，治疗组4周后，患者的ALT较治疗前有明显好转，TBil从12周始较治疗前有明显好转，肝脏的合成功能指标以及MELD评分从12 周始较治疗前有明显改善。对照组治疗后4周，患者的ALT较治疗前也有明显好转，TBil从12周始较治疗前也有明显好转；但MELD评分未见有明显变化。随访至48周，两组病死率及肝癌发生率均差异无统计学意义，考虑BMSC移植不会增加肝细胞癌发生率，同时因BMSC移植不能从根本上纠正患者肝硬化病因，因而未能减少患者病死率，但考虑BMSC可能定向分化为肝样细胞及自身的旁分泌等作用，有助于改善肝硬化患者的肝功能。

目前，进行BMSC移植治疗肝病的途径主要有经肝动脉、门静脉和外周静脉等[15]。姚鹏等[16]采用经肝动脉注入自体BMSC治疗慢性肝衰竭患者，证实其在改善患者症状和降低病死率方面效果明显。Pai等[17]将BMSC经肝动脉输入到酒精性肝硬化患者肝内，患者胆红素水平明显下降，Child-Pugh评分改善。其机制可能是肝动脉介入输注细胞可使干细胞在肝脏局部产生高浓度的细胞群，有利于其在肝脏中定植并发挥作用。

本研究采用经肝固有动脉移植自体BMSC治疗36例失代偿期肝硬化患者，发现干细胞治疗前后患者症状改善明显，治疗组与对照组在治疗后48周相比，血清肝功能及MELD评分改善方面有显著性差异。国内外的基础及临床研究均表明，BMSC移植治疗肝硬化主要有以下优点[18]：①BMSC移植来源方便，不受供体缺乏的限制，还可免除免疫排斥反应的发生；②治疗效果明显，可显著改善症状，在移植8～12周后干细胞开始分化，随着新的肝细胞不断增加，受损肝组织得到修复，肝功能逐渐恢复；③与活体肝移植相比费用低廉，且可以为肝脏移植赢得等待供体的时间；④技术风险小，手术本身过程并不复杂，加上采用的是介入微创手段，安全性较好，患者能够耐受手术。

综上所述，失代偿期肝硬化患者在常规治疗的前提下应用自体BMSC移植治疗，虽不能给患者带来治愈性的效果，但可以在很大程度上控制肝硬化的进展，提高肝硬化患者的生存质量，是在药物及原位肝移植治疗之外可供选择的治疗方案。

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(本文编辑：易玲)

Clinical study of autologous bone marrow mesenchymal stem cells transplantation through proper hepatic artery for decompensated cirrhosis patientsZHENGSheng1,YANGJuan1,LIUQiong2,LOUWei-xin2.1.DepartmentofLiverDiseases,YunnanThethirdPeople’sHospital,Kunming650011,China; 2.DepartmentofLiverDiseases,TheNo.533HospitalofPeople’sLiberationArmy,Kunming650000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the clinical therapeutic effect and safety of autologous bone marrow mesenchymal stem cells (BMSC) transplantation through proper hepatic artery in patients with decompensated liver cirrhosis. MethodsEighty-four patients with decompensated liver cirrhosis, which admitted in Department of Liver Diseases of the No.533 Hospital of People's Liberation Army from 2012 Jun to 2013 Jun, were randomly divided into transplantation group (n=36) and control group (n=48). Patients in control group received routine treatment, while patients in transplantation group received additional autologous BMSC transplantation through proper hepatic artery. Alanine aminotransferase (ALT), albumin (Alb), total bilirubin (TBil), prothrombin time (PT) and model for end stage liver disease (MELD) were evaluated in both groups during follow-up at week 4, 12, 24 and 48, respectively. Comparison of liver function at different time after therapy between two groups carried out by independent t test , F test and LSD test. Incidence of hepatocellular carcinoma (HCC) and mortality were analyzed by χ2 test. ResultsFour weeks after treatment, there were 15 cases (41.7%) ascites subsiding, 21 cases (58.3%) abdominal distention disappearing and 13 cases (36.1%) edema of lower limbs relieving in transplantation group, while there were 15 cases (31.3%), 20 cases (41.7%) and 11 case (22.9%) in control group, respectively, which revealed statistically significant differences (P<0.05). In transplantation group at week 4, 12, 24, 48, there were significant improvements in ALT, Alb, TBiL, PT and MELD (F=6.172, 9.795, 10.961, 11.198, 19.652, P=0.000, respectively) than those at baseline. In control group, some parameters, including ALT, Alb and TBiL, had significant improvement (F=5.594, 13.664, 12.612, P=0.000, respectively), while other parameters, including PT and MELD, did not changed before and after therapy. At week 48, ALT, Alb, TBiL, PT and MELD showed significant differences between transplantation and control groups (t=5.477, 8.830, 6.371, 11.362, 9.426, P<0.05, respectively). No significant differences were observed in incidence of HCC and mortality (χ2=4.815、6.286, P<0.05, respectively). Additionally, no severe adverse effects occured in patients during and after transplantation. ConclusionAutologous BMSC transplantation through proper hepatic artery for decompensated liver cirrhosis is a safe and effective therapy, which could be a bridging or a complementary treatment.

【Key words】Cirrhosis; Bone marrow mesenchymal stem cells; Transplantation, autologous; Hepatic artery; Treatment

(收稿日期：2015-08-03)

Corresponding author:ZHENG Sheng, Email: zheng_sheng523@163.com; YANG Juan, Email: 53573885@qq.com

通信作者：郑盛，Email：zheng_sheng523@163.com； 杨涓，Email：53573885@qq.com

基金项目：云南省自然科学基金(2012FD095)；云南省教育厅科研基金重点项目(2014Z125)