丙戊酸钠与顺铂联合应用对人骨肉瘤细胞株U-2 OS增殖、凋亡的影响及其作用机制

闫抗，夏斯龙，王业华

(1徐州医学院研究生学院，江苏徐州 221000；2徐州医学院附属医院)



丙戊酸钠与顺铂联合应用对人骨肉瘤细胞株U-2 OS增殖、凋亡的影响及其作用机制

闫抗1，夏斯龙1，王业华2

(1徐州医学院研究生学院，江苏徐州 221000；2徐州医学院附属医院)

摘要：目的观察丙戊酸钠(VPA)与顺铂(DDP)联合应用对人骨肉瘤细胞株U-2 OS增殖、凋亡的影响，并探讨其可能机制。方法 培养U-2 OS细胞，分为A、B、C、D组，A组加入35 mmol/L VPA+20 mg/L DDP，B组加入35 mmol/L VPA，C组加入20 mg/L DDP，D组未加任何药物。CCK-8法检测细胞增殖，流式细胞仪检测细胞周期及凋亡，RT-PCR法检测细胞凋亡相关基因(Caspase-3、Fas)。结果与D组比较，A、B、C组细胞存活率降低，G0/G1期细胞增加，凋亡率及Fas、Caspase-3相对表达量升高；与C组比较，A组细胞存活率降低，G0/G1期细胞增加，凋亡率及Fas、Caspase-3相对表达量升高；P均<0.05。结论 VPA联合DDP可抑制U-2 OS细胞增殖，促进其凋亡，且较单用VPA或DDP作用更为明显；其机制可能与Fas、Caspase-3表达上调有关。

关键词：骨肉瘤；丙戊酸钠；顺铂

骨肉瘤是青少年常见的恶性骨肿瘤，在小儿骨恶性肿瘤中最多见[1]。顺铂(DDP)是临床常用的化疗药物，但由于耐药性及不良反应等因素限制其疗效的进一步发挥。丙戊酸钠(VPA)属于短链脂肪酸家族，是临床广泛应用的广谱抗癫痫药，属于组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)[2]，具有抑制组蛋白去乙酰化活性的作用。研究[3]表明，VPA在体内外均可通过诱导细胞周期停滞，以促进细胞凋亡和分化，进而抑制多种肿瘤细胞的生长和增殖，其潜在的抗肿瘤作用越来越受到关注。2014年6月～2015年6月，我们观察了VPA与DDP联合应用对人骨肉瘤细胞U-2 OS增殖、凋亡的影响，并探讨其可能机制，旨在为骨肉瘤的治疗药物选择提供新的思路。

1材料与方法

1.1细胞株和试剂细胞株：人骨肉瘤细胞株U-2 OS(上海中科学院细胞库)，用含有10%胎牛血清的1640培养液在37 ℃、5%CO2条件下培养。主要试剂：VPA，DDP，胎牛血清，改良型1640培养基，细胞周期检测试剂盒，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，TRIzol试剂盒，Fas，Caspase-3，内参β-actin。

1.2VPA药物浓度筛选及U-2OS细胞分组、干预 ①VPA药物浓度筛选实验：分别用5、10、20、40 mmol/L共4个浓度分别处理细胞24、48 h，计算24 h的药物半数抑制浓度IC50[4]，并以此浓度作为下述联合用药实验中VPA浓度。②VPA、DDP联合用药实验：设A、B、C、D组，其中VPA浓度为VPA药物半数抑制浓度IC50，即35 mmol/L，DDP浓度为20 mg/L。

1.3U-2 OS细胞增殖检测取对数生长期U-2 OS细胞，常规消化，计数，调整细胞密度按5 000/孔，接种于96孔培养板，待细胞生长约70%后加药。A组加入35 mmol/L VPA+20 mg/L DDP，B组加入35 mmol/L VPA，C组加入20 mg/L DDP，A、B、C组为实验组；D组未加任何药物(对照组)。每个浓度设5个平行复孔，处理结束后加入CCK-8，轻摇，37 ℃孵育2 h，采用酶联免疫检测仪测定培养24、48 h每孔在450 nm波长处的吸光度(OD)。取5孔OD值的平均值，计算各组细胞的存活率，细胞存活率(%)=(A实验组/A对照组)×100%。

1.4U-2 OS细胞周期、凋亡检测取对数生长期U-2 OS细胞常规消化后计数，调整细胞密度按3×105/孔，接种于6孔培养板，待细胞生长约70%后加药。各组药物干预同上，药物作用细胞24 h后用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗涤细胞2次。①细胞周期测定：PBS洗涤后，调整细胞浓度为1×106/mL，取1 mL单细胞悬液，离心，去除上清，在细胞中加入体积分数为70%冷乙醇500 μL固定，4 ℃保存，过夜后用PBS洗去固定液；加入100 μL RNase A，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL的PI染色混匀，4 ℃避光30 min，上机检测记录激发波长488 nm处红色荧光，记录G0/G1期细胞数。②细胞凋亡率测定：PBS洗涤后，加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞，加入5 μL的Annexin V-FITC混匀，后加入5 μL的Propidium Iodide，混匀；室温、避光、反应5～15 min；流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.5U-2 OS细胞形态学观察倒置相差显微镜观察各组细胞经药物处理24 h后细胞形态学变化。

1.6U-2 OS细胞Fas、Caspase-3检测细胞处理及分组与“1.4”方法相同，药物作用24 h后用TRIzol、氯仿、异丙醇等试剂提取各组细胞总RNA，按照TIANScript RT Kit(cDNA第一链合成试剂盒)说明书逆转录成cDNA，然后按2×Taq Master Mix说明书进行PCR扩增，扩增后的DNA用2%琼脂糖凝胶进行电泳。采用凝胶成像系统对条带进行照相，Image J进行灰度值分析。

2结果

2.1各组细胞存活率、G0/G1期细胞、细胞凋亡率比较细胞存活率、G0/G1期细胞、细胞凋亡率比较见表1。

表1　各组细胞存活率、G0/G1期细胞、细胞凋亡率比较

注：与D组比较，*P<0.05；与C组比较，△P<0.05。

2.2各组细胞形态学变化D组U-2 OS细胞增殖良好；B、C组细胞数量减少，部分细胞由梭形变小、变圆，细胞质内颗粒增粗、增多，少量细胞脱落、裂解，可见少量凋亡小体，呈典型凋亡形态改变；A组细胞密度更低，凋亡现象更加明显。

2.3各组细胞Fas、Caspase-3相对表达量比较细胞Fas、Caspase-3相对表达量比较见表2。

表2　各组细胞Fas、Caspase-3相对表达量比较

注：与D组比较，*P<0.05；与C组比较，△P<0.05。

3讨论

骨肉瘤患者预后差，单纯手术治愈率仅15%～20%，约50%的患者术后复发。随着新辅助化疗技术的应用，骨肉瘤患者的5年生存率有所提高[5]，但在临床治疗过程中发现其对临床常用抗肿瘤药物如铂类、多柔比星、甲氨蝶呤等逐渐产生耐药性[6]，甚至是多重耐药，这对骨肉瘤的治疗效果造成极大的影响。

DDP是癌症化疗方案中的重要组分[7]，但细胞耐药性及不良反应限制其应用，因此设计与DDP的联合用药以增强DDP的化疗效果成为临床关注的热点[8]。有研究表明，HDACi能有效抑制肿瘤细胞增殖，其与多种化疗药物联用可有效增加抑癌效果。VPA是一种八碳支链的脂肪酸钠盐，属于HDACi，作为传统的抗癫痫药物，其不良反应轻，患者可长期使用，在抗癫痫治疗时表现出很强的组蛋白去乙酰化酶抑制剂活性。已有研究[9～11]表明，VPA对肺癌、淋巴瘤、肝癌等多种肿瘤细胞有抑制作用。然而，VPA联合DDP是否具有协同抗骨肉瘤作用鲜有报道。本研究显示，与D组比较，A、B、C组细胞存活率降低，凋亡率升高；与C组比较，A组细胞存活率降低，凋亡率升高。提示VPA联合DDP可抑制U-2 OS细胞存活，促进其凋亡，VPA联合DDP具有较强的协同抑癌活性，且较单用VPA或DDP作用更明显。

细胞凋亡是多种基因调控的结果，Fas基因作为重要的凋亡基因[12]，其表达的蛋白是诱导细胞程序性死亡的信号分子，在正常细胞内可通过信号转导途径逐级放大死亡信号，通过相应的受体传导至细胞核内部，引起核内转录基因的改变，从而启动凋亡程序。近年研究[13]表明，Fas在骨肉瘤中的表达与肺转移的发生呈负相关，提示通过改变Fas表达可以调整骨肉瘤细胞的侵袭能力。Caspase是由Caspase基因家族转录表达的一类具有酶切作用的蛋白质，目前发现有14种，Caspase-3为主要的凋亡执行蛋白[14]，被上游分子激活后能分解细胞的骨架蛋白、细胞器等结构，参与细胞凋亡的具体执行过程。本研究显示，A、B、C组Fas和Caspase-3相对表达量较D组升高，A组Fas和Caspase-3相对表达量较C组升高，表明VPA联合DDP可促进Fas、Caspase-3表达，且较单用VPA或DDP作用更为明显。

总之，VPA联合DDP可抑制U-2 OS细胞存活，促进其凋亡，且较单用VPA或DDP作用更为明显；其作用机制可能与Fas、Caspase-3表达上调有关。

参考文献：

[1] Samimi MA, Mirkheshti N, Pazouki A. Assessing the percent of necrosis after neoadjuvant chemotherapy with 24hr infusional cisplatin/3 days doxorubicin intermittent with ifosfamide-doxorubicin for osteosarcoma[J]. Int J Hematol Oncol Stem Cell Res, 2014,8(1):5-8.

[2] Giannini G, Cabri W, Fattorusso C, et al. Histone deacetylase inhibitors in the treatment of cancer: overview and perspectives[J]. Future Med Chem, 2012,4(11):1439-1460.

[4] 赵斌,葛金芳,朱娟娟,等.小议在MTT法测细胞增殖抑制率中IC50的计算方法[J].安徽医药,2007,11(9):834-836.

[5] Bacci G, Rocca M, Salone M, et al. High grade osteosarcoma of the extremities with lung metastases at presentation: treatment with neoadjuvant chemotherapy and simultaneous resection of primary and metastatic lesions[J]. J Surg Oncol, 2008,98(6):415-420.

[6] Wang J, LI G. Mechanisms of methotrexate resistance in osteosarcoma cell lines and strategies for overcoming this resistance[J]. Oncol Lett, 2015,9(2):940-944.

[7] Chiu TJ, Wang JW, Chen YJ, et al. Intraarterial cisplatin and intravenous adriamycin in nonmetastatic osteosarcoma of the extremities: a single institution experience in Taiwan[J]. Chang Gung Med J, 2009,32(1):72-80.

[8] Quattrini I, Conti A, Pazzaglia L, et al. Metformin inhibits growth and sensitizes osteosarcoma cell lines to cisplatin through cell cycle modulation[J]. Oncol Rep, 2014,31(1):370-375.

[9] Gavrilov V, Lavrenkov K, Ariad S, et al. Sodium valproate, a histone deacetylase inhibitor, enhances the efficacy of vinorelbine-cisplatin-based chemoradiation in non-small cell lung cancer cells[J]. Anticancer Res, 2014,34(11):6565-6572.

[10] Zheng Z, Cheng S, Wu W, et al. c-FLIP is involved in tumor progression of peripheral T-cell lymphoma and targeted by histone deacetylase inhibitors[J]. J Hematol Oncol, 2014,7(1):88.

[11] Matsuda Y, Wakai T, Kubota M, et al. Valproic acid overcomes transforming growth factor-beta-mediated sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(4):1299-1313.

[12] 陈楷,吕书军,付东,等.骨肉瘤凋亡与耐药相关机制的研究进展[J].中国骨与关节杂志,2015,4(1):45-49.

[13] Rao-Bindal K, Koshkina NV, Stewart J, et al. The histone deacetylase inhibitor, MS-275 (entinostat), downregulates c-FLIP, sensitizes osteosarcoma cells to FasL, and induces the regression of osteosarcoma lung metastases[J]. Curr Cancer Drug Targets, 2013,13(4):411-422.

[14] 张巍.细胞凋亡与肿瘤化疗的研究进展[J].医学综述,2013,19(3):451-453.

Effect and mechanism of sodium valproate combined with cisplatin on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line U-2 OS

YANKang1,XIASilong,WANGYehua

(1GraduateSchoolofXuzhouMedicalCollege,Xuzhou221000,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the effect and mechanism of the sodium valproate (VPA) combined with cisplatin (DDP) on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line U-2 OS. MethodsThe osteosarcoma U-2 OS cells were cultured in vitro and were divided into groups A, B, C and D. The groups A, B and C were separately treated with 35 mmol/L VPA+20 mg/L DDP, 35 mmol/L VPA and 20 mg/L DDP, and the group D was not treated. The proliferation was assayed by CCK-8. The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry (FCM). The gene expression of Fas and Caspase-3 was detected by RT-PCR. ResultsCompared with group D, the cell viabilities of groups A, B and C were decreased, the cells in the G0/G1phase were increased, the apoptosis rate and the expression levels of Fas and Caspase-3 genes were increased; compared with group C, the cell viability of the group A decreased, the cells in the G0/G1phase were increased, the apoptosis rate and the expression levels of Fas and Caspase-3 genes increased. The difference was statistically significant (all P<0.05).Conclusions VPA combined with DDP could inhibit the cell proliferation and induce to apoptosis of human osteosarcoma U-2 OS, and the effect is more obvious than that of using only one of them. The mechanism may be closely related to the up-regulated expression of Fas and Caspase-3.

Key words:osteosarcoma; sodium valproate; cisplatin

(收稿日期:2015-09-23)

作者简介：第一闫抗(1990-)，男，硕士在读，主要研究方向为创伤外科。E-mail: xzmcyankang@163.com

中图分类号：R738.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)03-0011-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.004

通信作者简介：王业华(1966-)，男，博士，主任医师，主要研究方向为创伤外科。E-mail: 736283162@qq.com