SOCS2基因转染对人肾小球系膜细胞TGF-β、Ⅳ型胶原蛋白、纤维连接蛋白表达的影响

周月宏，田坚，沈静雪，赵晓伟(沈阳医学院附属中心医院，沈阳 110024)



SOCS2基因转染对人肾小球系膜细胞TGF-β、Ⅳ型胶原蛋白、纤维连接蛋白表达的影响

周月宏，田坚，沈静雪，赵晓伟(沈阳医学院附属中心医院，沈阳 110024)

摘要：目的观察过表达细胞因子信号转导抑制因子(SOCS2)对人肾小球系膜细胞(HMCs)中转化生长因子β(TGF-β)、Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)、纤维连接蛋白(FN)表达的影响，并探讨其可能机制。方法 体外培养HMCs，分为A、B、C、D、E、F组，A、B组分别加入Ad-SOCS2病毒液(含SOCS2的腺病毒病毒液)、Ad-null病毒液(只含腺病毒的病毒液)，24 h后将培养液更换成高糖培养液；C组加入30 mmol/L的D-葡萄糖；D、E组分别加入Ad-SOCS2病毒液、Ad-null病毒液，24 h后将培养液更换成常规培养液；F组加入5.5 mmol/L的D-葡萄糖+24.5 mmol的D-甘露醇。Western blotting法检测各组TGF-β、Collagen Ⅳ、FN及贾纳斯激酶2(JAK2)、信号传导及转录激活因子3(STAT3)、磷酸化贾纳斯激酶2(p-JAK2)、磷酸化信号传导及转录激活因子3(p-STAT3)。结果与F组比较，A、B、C组TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、p-JAK2、p-STAT3的相对表达量升高；与C组比较，A组TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、p-JAK2、p-STAT3的相对表达量降低；P均<0.01。结论 SOCS2通过抑制JAK/STAT信号通路来下调HMCs中TGF-β、Collagen Ⅳ、FN表达。

关键词：细胞因子信号转导抑制因子；肾小球系膜细胞；转化生长因子β；Ⅳ型胶原蛋白；纤维连接蛋白

糖尿病肾病(DN)是由糖尿病引起的一种危害性大的慢性并发症，肾小球系膜细胞作为DN的主要效应细胞，在DN的发生发展中发挥重要作用。近年来，有关细胞因子信号转导抑制因子(SOCS)抑制细胞因子信号转导的研究取得进展，特别是对JAK/STAT信号通路的负反馈作用被证实。JAK/STAT信号通路被证实与肾脏疾病的足细胞、系膜细胞、肾小管上皮细胞的病理改变相关[1]。研究[2,3]认为，SOCS1、SOCS3对DN肾组织有保护作用，而SOCS2是否对其有保护作用尚不清楚。2014年3～8月，我们观察了过表达SOCS2对人肾小球系膜细胞中纤维化相关蛋白表达的影响，并探讨其可能机制，为DN的防治提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料人肾小球系膜细胞(HMCs)、SOCS2抗体，Ⅳ型胶原蛋白(Collagen Ⅳ)、贾纳斯激酶2(JAK2)、信号传导及转录激活因子3(STAT3)、磷酸化贾纳斯激酶2(p-JAK2)、磷酸化信号传导及转录激活因子3(p-STAT3)抗体；转化生长因子β(TGF-β)抗体；胎牛血清；纤维连接蛋白(FN)抗体；DMEM低糖培养基；Polybrene；SOCS2腺病毒套装；PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、一抗二抗去除液、羊抗兔IgG-HRP、NP-40裂解液；β-actin和辣根过氧化物酶标记的鼠单克隆抗体；ECL发光液。

1.2HMCs培养及高糖处理将HMCs接种于含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基中，培养至密度为90%左右，PBS清洗。弃上清，加入适当体积的0.25%胰酶消化细胞，待细胞变圆后，轻轻拍打瓶壁侧面，并加入常规培养基终止反应。用5 mL枪头吹打细胞瓶内各处细胞，15 mL试管收集混合液，800 r/min离心3 min。去上清，进行细胞计数，按实验内容接种细胞，将培养瓶置于37 ℃、5%CO2的培养箱内培养。HMCs的接种密度为1∶2，生长2～3 d传代。细胞培养至密度为70%左右，用PBS清洗2次。弃去上清，以PBS清洗1次，加入高糖培养基(将0.9 g葡萄糖溶解在200 mL含有10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基中，过滤后使用，浓度为30 mmol/L D-葡萄糖)。

1.3HMCs分组及处理将HMCs接种于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2的培养箱内培养过夜，24 h后进行感染，细胞密度一般在70%。实验分为6组。A、B组分别加入含有SOCS2的腺病毒病毒液、只含有腺病毒的病毒液(病毒数与细胞数比值为10∶1)，24 h后将含有腺病毒的培养液更换成高糖培养液，37 ℃、5%CO2继续培养24 h。C组：将0.9 g葡萄糖溶解在200 mL含有10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基中，过滤后使用，浓度即为30 mmol/L D-葡萄糖。D、E组分别加入含有SOCS2的腺病毒病毒液、只含有腺病毒的病毒液(病毒数与细胞数比值为10∶1)，24 h后将含有腺病毒的培养液更换成正常培养液，37 ℃、5%CO2继续培养24 h。F组：将0.9 g甘露醇溶解在200 mL含有10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基中，过滤后使用，浓度即为5.5 mmol/L D-葡萄糖+24.5 mmol D-甘露醇。

1.4HMCs中TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、JAK、STAT、p-JAK2、p-STAT3检测采用Western blotting法。收集细胞，用NP-40裂解液(含1%PMSF)裂解细胞，离心后取上清，用BCA法测定蛋白浓度，同时加5×上样缓冲液，煮沸变性5 min，-80 ℃保存备用。本实验的上样体积20 μL，含40 μg蛋白。最后加入5 μL蛋白Marker电泳，半干转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，将SOCS2、TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、JAK、STAT、p-JAK2、p-STAT3特异性抗体分别与膜4 ℃孵育过夜。再以相应的二抗(1∶5 000)孵育2 h。免疫复合物使用ECL法检测。使用Gel Pro Analyzer软件分析条带灰度值，实验重复3次。

2结果

2.1各组TGF-β、Collagen Ⅳ、FN的相对表达量比较TGF-β、Collagen Ⅳ、FN的相对表达量比较见表1。

表1　各组TGF-β、Collagen Ⅳ、FN的相对表达量比较±s)

注：与F组比较，*P<0.01；与C组比较，△P<0.01。

2.2各组JAK、STAT、p-JAK2、p-STAT3的相对表达量比较JAK、STAT、p-JAK2、p-STAT3的相对表达量比较见表2。

表2　各组JAK、STAT、p-JAK2、p-STAT3的相对表达量比较±s)

注：与F组比较，*P<0.01；与C组比较，△P<0.01。

3讨论

DN的发病机制目前尚不明确，由糖尿病引起的微血管病变而导致肾小球硬化是本症的特点。多数学者认为，DN由多种因素导致，包括血流动力学、代谢、炎症、氧化应激、遗传等[4,5]。

SOCS家族是一类对细胞因子信号转导起负性调控，从而抑制其信号转导的蛋白分子。研究[6～9]证实，SOCS参与癌症、肝纤维化、肾脏纤维化和各种炎症反应。SOCS主要通过JAK/STAT信号转导通路的负性调节作用抑制相关细胞因子的信号转导，从而参与了多种生理与病理的发生发展过程。研究证实，JAK/STAT与多种肾脏疾病相关细胞及炎症相关细胞有关。目前，对于SOCS家族的研究多集中于SOCS1和SOCS3[10～12]，而关于SOCS2的研究甚少。在肿瘤组织中，SOCS2能抑制JAK2的激活以及JAK2、STAT3的结合，SOCS2过表达可阻止STAT3激活及抑制c-Src蛋白所影响细胞的毒性[13]。有研究[10]表明，链佐脲菌素诱导的糖尿病大鼠肾脏组织中SOCS2表达降低，胰岛素可诱导肾小球系膜细胞SOCS2表达上调，且上调的SOCS2可以抑制IGF-1诱导的ERK1/2的激活，从而抑制Collagen Ⅳ的合成。我们的前期研究[14]已证实，在DN动物模型中，SOCS2可抑制JAK/STAT和ERK1/2信号通路，调控下游基因的表达，从而抑制肾脏组织的纤维化反应。

TGF-β是高血糖及一些导致肾脏损伤的生化因素的重要介质，与DN肾脏细胞的增殖、肾小球肥大等密切相关，同时也与肾间质的纤维化有关[15]。肾小球基底膜的胶原成分中最重要的是Collagen Ⅳ，它是典型的基质胶原，可由活化的肾小球系膜、上皮细胞、内皮细胞、肾小管上皮细胞等合成和分泌。所以，Collagen Ⅳ合成和降解平衡的失调是导致DN肾小球病理改变的主要因素之一[16]。FN是重要的细胞外基质组成成分，正常情况下其由系膜细胞产生，病理状态下系膜细胞大量表达FN等细胞外基质成分。

本研究显示，与F组比较，A、B、C组TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、p-JAK2、p-STAT3的相对表达量升高；与C组比较，A组TGF-β、Collagen Ⅳ、FN、p-JAK2、p-STAT3的相对表达量降低。这说明SOCS2能通过抑制JAK/STAT信号通路及其调控的纤维化相关因子的活化与表达，从而减少纤维化，对DN的进展起到延缓作用，为DN药物的治疗找到了新的靶点，同时也为该病的防控提供理论依据。

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Effect of SOCS2 gene transfection on expression of TGF-β, Collagen Ⅳ and FN in human glomerular mesangial cells

ZHOUYuehong,TIANJian,SHENJingxue,ZHAOXiaowei

(TheCenterHospitalAffiliatedtoShenyangMedicalCollege,Shenyang110024,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of overexpressing suppressor of cytokine signaling 2 (SOCS2) on the expression of transforming growth factor β (TGF-β), Collagen Ⅳ and fibronectin (FN) in human glomerular mesangial cells (HMCs) and to investigate its possible mechanisms.MethodsHMCs cultured in vitro were divided into groups A, B, C, D, E and F. Groups A and B were respectively added with Ad-SOCS2 venom (containing SOCS2 adenovirus) and Ad-null venom (containing adenovirus), after 24 h, we changed the nutrient solution into high glucose solution; group C was added with 30 mmol/L D-glucose; groups D and E were respectively added with Ad-SOCS2 venom and Ad-null venom, after 24 h, we changed the venom into conventional solution; group F was added with 5.5 mmol/L D-glucose + 24.5 mmol D-mannitol.Western blotting was used to detect the TGF-β, Collagen Ⅳ, FN and Janus kinase 2 (JAK2), signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3), phosphorylated Janus kinase 2 (p-JAK2) and phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3 (p-STAT3).ResultsCompared with group F, the expression of TGF-β, Collagen Ⅳ, FN, p-JAK2, and p-STAT3 was significantly increased in the groups A, B and C; compared with group C, the expression of TGF-β, Collagen Ⅳ, FN, p-JAK2 and p-STAT3 in the group A was significantly decreased (all P<0.01). ConclusionSOCS2 can down-regulate the expression of TGF-β, Collagen Ⅳ and FN in HMCs by inhibiting JAK/STAT signaling pathway.

Key words:suppressor of cytokine signaling; mesangial cells; transforming growth factor β; Collagen IV; fibronectin

(收稿日期:2015-09-25)

中图分类号：R587.2

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)03-0017-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.006

作者简介：第一周月宏(1978-)，女，博士，副主任医师，副教授，主要研究方向为糖尿病并发症。E-mail: zyhwylwys@163.com

基金项目：沈阳市科技计划项目(F13-220-9-10)。