活性维生素D3灌胃治疗大鼠糖尿病肾病的效果及其作用机制

徐园园，魏迎凤，卢学超，解其华，翟林云 (南通市第三人民医院，江苏南通226000)



活性维生素D3灌胃治疗大鼠糖尿病肾病的效果及其作用机制

徐园园，魏迎凤，卢学超，解其华，翟林云 (南通市第三人民医院，江苏南通226000)

摘要：目的观察活性维生素D3灌胃治疗大鼠糖尿病肾病的效果，并探讨其机制。方法 雄性SD大鼠40只，随机分为对照组、模型组、实验1组、实验2组及实验3组各8只。模型组、实验1组、实验2组及实验3组采用链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病肾病大鼠模型，对照组注射同体积的枸橼酸钾缓冲液。实验1、2、3组分别以0.03、0.06、0.12 μg/(kg·d)骨化三醇(活性维生素D3)灌胃，1次/d，模型组与对照组以等量花生油灌胃。各组均连续用药8周。灌胃结束后测定24 h尿蛋白(24 h UTP)、空腹血糖(FBG)、血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、血钙、血磷、25-(OH)D3及甲状旁腺激素(PTH)。留取标本后处死各组大鼠，取肾脏组织，HE染色，光镜下观察肾脏病理学改变；采用免疫组化法检测各组大鼠肾脏组织中的转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)蛋白。结果实验1、2、3组及模型组的FBG、24 h UTP、BUN、Scr均高于对照组(P均<0.05)；实验1、2、3组的24 h UTP、BUN、Scr低于模型组，其中实验3组24 h UTP低于实验1组(P均<0.05)。实验1、2、3组肾脏病理改变较模型组减轻，以实验3组最为明显。模型组肾脏组织中TGF-β1、CTGF表达高于对照组(P均<0.05)；实验1、2、3组TGF-β1、CTGF表达低于模型组，其中实验3组TGF-β1、CTGF表达低于实验1组(P均<0.05)。与实验1组相比，实验3组PTH水平下降，血钙、血磷水平升高(P均<0.05)。结论 活性维生素D3灌胃可减轻糖尿病肾病大鼠肾组织病理改变，改善肾功能，其机制可能与下调TGF-β1、CTGF表达有关；但活性维生素D3以0.12 μg/(kg·d)剂量使用将影响骨质代谢。

关键词：糖尿病并发症；糖尿病肾病；活性维生素D3；转化生长因子β1；结缔组织生长因子；动物实验

糖尿病肾病是导致糖尿病患者终末期肾衰竭的重要原因。目前认为转化生长因子β1(TGF-β1)和结缔组织生长因子(CTGF)是糖尿病患者肾小球硬化形成过程中的重要生长因子[1]。近年来，活性维生素D3的肾脏保护作用备受关注。2014年8~12月，本研究观察了活性维生素D3对大鼠糖尿病肾病的治疗作用，并探讨其机制。现报告如下。

1材料与方法

1.1实验动物及试剂健康雄性SD大鼠40只，清洁级，体质量(260±20)g，由南通大学实验动物中心提供。骨化三醇胶丸(活性维生素D3)购自上海罗氏制药有限公司；链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，用前溶解于0.1 mol/L的柠檬酸缓冲液中，pH 4.5；兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗体购自美国Abcam公司；兔抗大鼠CTGF多克隆抗体购自美国Abcam 公司；即用型SABC-POD(兔IgG)试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2动物模型制作及活性维生素D3用法大鼠适应性喂养1周后，随机分为对照组、模型组、实验1组、实验2组及实验3组各8只。模型组、实验1组、实验2组及实验3组大鼠禁食12 h后以60 mg/kg的STZ于左下腹腔一次性注射制造糖尿病肾病模型，以建模72 h后血糖浓度≥16.7 mmol/L、尿量多于原尿量150%、24 h尿蛋白排泄率>30 mg判定为造模成功。对照组注射同体积的枸橼酸钾缓冲液[2]。实验1、2、3组将骨化三醇溶于0.05 mL花生油，分别以0.03、0.06、0.12 μg/(kg·d)灌胃，模型组与对照组以等量花生油灌胃。各组均连续用药8周。于实验第8周末收集大鼠尿液，采血，解剖肾脏去除包膜，留取肾脏组织。

1.3大鼠肾功能相关指标检测于实验第8周末留取标本后处死大鼠。处死前1 d，将大鼠放入洗净的代谢笼内，禁食不禁水，收集24 h尿液，用双缩脲法测定24 h UTP。采用全自动多功能生化分析仪进行测定FBG、血清BUN、Scr、血钙、血磷。采用罗氏电化学发光法检测血清25羟维生素D3[25-(OH)D3]。采用化学发光微粒子免疫分析法检测血清PTH。

1.4大鼠肾脏组织病理观察留取各组大鼠肾组织，置于4%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片，行HE染色，光镜下观察肾组织病理改变。

1.5大鼠肾脏组织中TGF-β1、CTGF检测采用免疫组化法检测大鼠肾脏组织中TGF-β1、CTGF。以细胞质中出现棕黄色颗粒为TGF-β1、CTGF表达阳性，光镜下(400×)每张切片随机选取10个区域，采用Mias-2000图像分析系统测定阳性细胞的积分光密度，以此代表TGF-β1、CTGF相对表达量。

2结果

2.1各组大鼠肾功能相关指标比较实验1、2、3组及模型组的FBG、24 h UTP、BUN、Scr均高于对照组(P均<0.05)；实验1、2、3组的24 h UTP、BUN、Scr低于模型组(P均<0.05)，其中实验3组24 h UTP低于实验1组(P<0.05)。详见表1。

表1　各组大鼠肾功能相关指标比较±s)

注：与对照组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05；与实验1组相比，△P<0.05。

2.2各组大鼠肾脏病理改变对照组肾小球体积正常，系膜细胞及基质正常，无炎症细胞浸润；模型组肾小球体积增大，肾小球系膜基质增宽，部分肾小球硬化，并有炎症细胞浸润；实验1、2、3组肾小球体积减小，系膜增生改善，炎症细胞减少，以实验3组最为明显。

2.3各组大鼠肾脏组织中TGF-β1、CTGF表达比较模型组肾脏组织中TGF-β1、CTGF表达高于对照组(P均<0.05)；实验1、2、3组的TGF-β1、CTGF表达低于模型组(P均<0.05)，其中实验3组TGF-β1、CTGF表达低于实验1组(P均<0.05)。详见表2。

2.4各组大鼠骨质代谢指标比较与对照组比较，模型组25-(OH)D3下降、PTH升高(P均<0.05)；与模型组比较，实验1、2、3组25-(OH)D3升高、PTH下降，实验2组血磷水平升高，实验3组血钙、血磷水平升高(P均<0.05)；实验2、3组25-(OH)D3、血磷水平高于实验1组(P均<0.05)；实验3组PTH低于实验1组、血钙水平高于实验1组(P<0.05)。详见表3。

表2　各组大鼠肾脏组织中TGF-β1、CTGF表达比较

注：与对照组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05；与实验1组相比，△P<0.05。

表3　各组大鼠25-(OH)D3、PTH、血钙、血磷水平比较±s)

注：与对照组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05；与实验1组相比，△P<0.05。

3讨论

糖尿病肾病发病机制复杂，目前尚未阐明。糖尿病肾病的共同病理变化为细胞外基质(ECM)进行性积聚，细胞因子在此过程中起关键作用。在糖尿病肾病患者中，高血糖、蛋白糖基化、肾小球内压升高等因素均能刺激TGF-β1、CTGF等多种细胞因子过度表达，引起ECM合成及降解失衡，促使ECM在肾脏过度积聚，并最终导致肾小球硬化和肾间质纤维化。

TGF-β1是目前研究最多、最重要的促纤维化因子之一，其在糖尿病肾病的发生及发展过程中发挥重要作用。有报道，糖尿病肾病大鼠肾脏组织中TGF-β1mRNA、蛋白表达均显著增高，且与肾脏损害的严重程度相关[3，4]。TGF-β1参与了肾小球硬化发生发展的多个环节[5~8]。TGF-β1可通过smad3信号转导通路使肾小球系膜细胞合成过多纤维连接蛋白，加重肾小球硬化[5]；TGF-β1可下调基质金属蛋白酶(MMP)表达，增强MMP特异性抑制物合成，从而促进系膜细胞合成及ECM分泌，导致基底膜增厚、系膜细胞增殖，引起肾小球硬化[6，7]。CTGF在维持细胞外基质的动态平衡中发挥重要作用[9]。CTGF可被TGF-β1诱导并激活，并可作为TGF-β1的下游介质，与TGF-β1共同参与肾小球肥大、系膜细胞增殖、ECM积聚等过程。Yamanaka等[10]在体外实验中抑制人结膜成纤维细胞内源性CTGF表达，发现即使在培养液中加入TGF-β1，Ⅰ型胶原蛋白、纤维连接蛋白等ECM成分表达也显著减少，说明CTGF表达受TGF-β1调节，同时也可调节TGF-β1活性。CTGF生物学效应较为单一，阻断CTGF表达或抑制其生物活性有望成为治疗肾脏纤维化的新手段。

活性维生素D3是一种脂溶性维生素，有调节钙磷代谢及骨质形成的作用。近期研究[11]证实，活性维生素D3还具有抗炎、抑制肾素血管紧张素系统、减少尿蛋白、调节免疫等作用。糖尿病肾病患者普遍存在活性维生素D3缺乏。研究[12，13]表明，应用活性维生素D3治疗糖尿病肾病大鼠可改善肾小球滤过屏障功能，减轻炎症反应，减轻足细胞损伤，减少蛋白尿，并可下调TGF-β1水平，从而起到延缓肾小球硬化的作用。杨烨等[14]发现TGF-β1表达水平越高，糖尿病肾病大鼠肾脏病理改变越严重，且活性维生素D3可通过下调TGF-β1表达而保护肾脏。目前尚无活性维生素D3治疗糖尿病肾病的相关标准，对于适宜药物剂量及该药对骨质代谢的影响仍未明确。

本研究制备了大鼠糖尿病肾病模型，并给予活性维生素D3干预，结果显示，实验1、2、3组的24 h UTP、BUN、Scr低于模型组，其中实验3组24 h UTP低于实验1组；实验1、2、3组肾脏病理改变较模型组减轻，以实验3组最为明显；实验1、2、3组的TGF-β1、CTGF表达低于模型组。上述结果再次证实TGF-β1、CTGF参与了糖尿病肾病发生发展[15]，而给予活性维生素D3治疗可减轻肾脏组织病理改变，改善肾功能，这些治疗作用可能与下调TGF-β1、CTGF表达有关。值得注意的是，实验3组PTH水平下降，血钙、血磷水平升高，提示活性维生素D3剂量过大[0.12 μg/(kg·d)]可影响骨质代谢，故治疗剂量还应谨慎选择。对于临床如何使用活性维生素D3治疗糖尿病肾病仍需大量的循证医学证据，有待进一步研究。

参考文献：

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(收稿日期：2015-10-27)

中图分类号：R587.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)03-0031-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.011

基金项目：南通市卫生局青年科研基金资助项目(WQ2014029)。