高压氧与神经生长因子联合应用对HIBD新生大鼠学习记忆能力和感觉运动功能的影响

魏丽夏，任青，王金慎，赵丽丽，张勇军(聊城市人民医院，山东聊城 252000)



高压氧与神经生长因子联合应用对HIBD新生大鼠学习记忆能力和感觉运动功能的影响

魏丽夏，任青，王金慎，赵丽丽，张勇军(聊城市人民医院，山东聊城 252000)

摘要：目的观察高压氧(HBO)与神经生长因子(NGF)联合应用对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠学习记忆能力和感觉运动功能的影响。方法 40只SD大鼠随机分为5组各8只，A、B、C、D组大鼠均制备HIBD模型，制模后A组采用HBO联合NGF治疗，B组采用HBO治疗，C组采用NGF治疗，D组不干预；E组大鼠右侧颈总动脉只分离而不结扎，术后不给予缺氧，不干预治疗。各组大鼠生后30 d进行Morris水迷宫测试，比较两组连续5 d逃避潜伏期及穿环指数；生后42 d进行感觉运动功能测试，比较两组足错误次数左右差值、肢体放置左右差值。结果与E组比较，A组和C组第1、3、4、5天逃避潜伏期长，B组第1、5天逃避潜伏期长，D组第1～5天逃避潜伏期长；与D组比较，A、B、C、E组穿环次数多；与E组比较，A、B、C、D组肢体放置左右差值大；与D组比较，A、B、C、E组足错误次数左右差值小，肢体放置左右差值小；P均<0.05。结论 HBO与NGF联合应用可改善HIBD新生大鼠学习记忆力和感觉运动功能。

关键词：高压氧；神经生长因子；缺氧缺血性脑损伤；学习记忆能力；感觉运动功能

新生儿缺氧缺血性脑损伤(HIBD)远期可引起智力障碍、癫痫、运动缺陷和认知、学习障碍，而新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)是指由于围生期缺氧窒息所导致的HIB，是新生儿期死亡和致残的主要原因。高压氧(HBO)疗法是指机体处于高气压环境中，呼吸与环境等压的高压纯氧或高压混合氧，从而达到治疗疾病的目的。神经生长因子(NGF)是一种神经营养因子，不仅对正常神经细胞有营养保护作用，还能促进损伤神经元再生和功能恢复，改善神经元的病理状态。本研究观察了HBO与NGF联合应用对HIBD新生大鼠学习记忆能力和感觉运动功能的影响，旨在为两者的临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验动物、主要仪器及试剂健康7日龄SD大鼠40只，体质量(14.5±3.2)g，雌雄不限。RSS-5100便携式数字测氧仪(上海隆拓仪器设备有限公司)，YLC0.5/1A婴儿高压氧舱(中国船舶工业总公司第701研究所)，Morris水迷宫(MT-200，成都泰盟科技有限公司)，Recombinant Rat β-NGF(R&D公司)，氮氧混合气(贵阳申建气体有限公司)。

1.2实验动物分组、HIBD模型制备及HBO、NGF干预40只SD大鼠随机分为5组各8只。A、B、C、D组大鼠均制备HIBD模型[1]，即首先将大鼠以仰卧位固定于手术板上，颈部常规消毒，正中切口，长约0.3 cm，血管钳轻柔分离右侧颈总动脉，用0号无菌线双线结扎，无菌手术刀剪断下中，然后用无菌一次性缝线缝合切口。缺血术后将大鼠置于8%低氧环境(自制的新生大鼠缺氧装置)，将8%O2+92%N2以1～2 L/min的速度输入缺氧装置，2 h后大鼠从缺氧装置中取出，缺血缺氧后返回母鼠身边继续哺乳喂养。A组大鼠脑缺氧缺血术后30 min内先腹腔注射0.5 μg的NGF，连续3 d；后采用HBO治疗，1次/d，共7 d。B组大鼠脑缺氧缺血术后15～30 min采用HBO治疗，1次/d，共7 d。C组大鼠脑缺氧缺血术后30 min内腹腔注射0.5 μg的NGF，连续3 d。D组脑缺氧缺血后，正常饲养，不干预。E组大鼠右侧颈总动脉只分离而不结扎，术后不给予缺氧，不干预治疗。

1.3大鼠学习记忆能力测试各组大鼠于出生后第30天进行Morris水迷宫实验，包括定位航行实验和空间搜索实验。①定位航行实验：主要通过测试逃避潜伏期(大鼠寻找并爬上平台的路线图和所需时间)来判断大鼠水迷宫学习和记忆能力。实验开始前1 d先将大鼠放入水池中(不放平台)自由游泳2 min，使其熟悉迷宫环境。正式实验共进行5 d，每天分上午和下午两个时间段，每段时间训练4次，分别从4个不同的入水点入水。实验记录其大鼠逃避潜伏期，如果实验大鼠在120 s内未找到平台，则需将其拿上平台，记录逃避潜伏期为120 s，每次训练时间间隔60 s。②空间搜索实验：用于检测大鼠学会寻找平台后，对平台空间位置记忆的保持能力。第6天撤除原平台，将大鼠任选1个入水点放入水中，所有大鼠必须为同一入水点，记录大鼠在2 min内跨越原平台的次数，称为穿环指数。

1.4大鼠感觉运动功能测试各组大鼠于出生后第42天进行感觉运动功能测试，包括足错误实验和肢体放置实验。①足错误实验：将大鼠放在水平的金属网格上(50 cm×40 cm，每格3 cm×3 cm，金属丝直径0.4 cm)，记录2 min内大鼠前、后爪掉下来的次数。因不同大鼠活动度有个体差异，只记录左右侧错误次数的差值。②肢体放置实验：记录大鼠在不同的感觉刺激下左右侧前后爪的放置情况，计分标准：爪子放置正确、迅速计0分，迟缓或不完全正确计1分，未放置计2分，记录每只大鼠两侧得分的差值。

2结果

2.1各组逃避潜伏期、穿环指数比较连续5 d逃避潜伏期、穿环指数比较见表1。

表1　各组连续5 d逃避潜伏期、穿环指数比较±s)

注：与E组比较，*P<0.05，△P<0.01；与D组比较，﹟P<0.01。2.2各组足错误次数左右差值、肢体放置左右差值比较足错误次数左右差值、肢体放置左右差值比较见表2。

3讨论

新生儿HIBD是由于围产期窒息而导致的缺氧缺血性脑损害，目前治疗以对症支持治疗为主，但迄今仍无有效治疗措施来减轻HIBD后遗症[2]。中重度HIBD患儿有很高的病死率，存活者可能遗留严重神经系统后遗症，如脑瘫、认知障碍、学习障碍、癫痫等[3～6]。

表2　各组足错误次数左右差值、肢体放置左右差值比较

注：与E组比较，*P<0.05，△P<0.01；与D组比较，﹟P<0.01。

HBO疗法是指机体处于高气压环境中，呼吸与环境等压的高压纯氧或高压混合氧，从而达到治疗疾病的目的。研究[7,8]认为，HBO对HIBD脑组织有保护。然而，HBO在脑损伤中的应用及应用效果一直存在争议。有研究[9]证明，新生大鼠HIBD缺氧缺血后6 h内进行HBO治疗为最佳时间窗，缺氧缺血后12 h进行HBO治疗反而会加重病情[10]。刘丽旭等[11]利用新生大鼠制备HIBD模型，发现选择2ATA压力、稳压时间为30～60 min的HBO治疗大鼠脑损伤效果最佳，过高的HBO压力反而加重脑组织损伤。

NGF是发现最早的一种神经营养因子，是由118个氨基酸组成的蛋白质。NGF不仅对正常神经细胞有营养保护作用，还能促进损伤神经元再生和功能恢复，改善神经元的病理状态[12]，保护和修复缺氧缺血后受损神经[13]。在胚胎时期，NGF分布广、含量多，为效应神经元生存所必须。出生后，NGF分布区域逐渐减少、含量下降。NGF在神经损伤后可应激性上调表达，但这种表达时间短、NGF含量较低，不足以全面而持久保护受损神经[14]。因此，外源性NGF的供给是十分必要的。国内外研究证明，在新生动物发生HIBD时，NGF是可以通过血脑屏障的，此为外源性NGF治疗新生儿HIBD提供了可能理论。

学习记忆是大脑最重要的高级神经活动之一，是中枢神经功能的整合，学习和记忆是两个不同又相关联的神经生物过程。水迷宫行为测定实验是判定动物空间学习记忆的传统经典方法。30日龄大鼠的脑发育水平与人类幼儿期脑发育水平相当，是智能发育的关键期，故选用此时间点研究学习记忆能力。感觉运动功能结果受个体差异因素影响，本实验采用足错误和肢体放置实验两项测试提高研究的准确性。本研究显示，A组和C组第1天、第3天、第4天、第5天逃避潜伏期较E组长，B组第1天、第5天逃避潜伏期较E组长，D组第1～5天逃避潜伏期较E组长；A、B、C、E组穿环次数较D组多；A、B、C、D组肢体放置左右差值较E组大；A、B、C、E组足错误次数左右差值较D组小，肢体放置左右差值较D组小。提示HBO与NGF联合应用能够改善HIBD新生大鼠学习记忆能力和感觉运动功能。

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(收稿日期:2015-09-07)

中图分类号：R722.1

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2016)03-0025-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.009