HPV18型与早期子宫颈腺癌患者预后的相关性

潘在轩，陈敏

(琼海市人民医院病理科，海南 琼海 571400)

HPV18型与早期子宫颈腺癌患者预后的相关性

潘在轩，陈敏

(琼海市人民医院病理科，海南 琼海 571400)

目的 探讨人乳头状瘤病毒(HPV)18型与早期子宫颈腺癌患者预后的相关性。方法 选取2000年1月至2011年1月琼海市人民医院收治的110例子宫颈腺癌患者作为研究对象，采用PCR法进行HPV基因型检测，比较HPV18型感染与患者预后的关系。结果 110例宫颈腺癌患者中HPV 18型阳性者66例，占60.00%。HPV 18型阳性者的淋巴结转移率(27.27%)、脉管瘤栓率(24.24%)明显高于阴性者(6.82%，4.85%，P＜0.05)。HPV 18型阳性患者与阴性患者的5年无瘤生存率(86.36%vs 86.36%)、5年总生存率(87.88%vs 90.91%)、无瘤生存时间[(63.54± 10.54)个月vs(65.01±12.41)个月]、总生存时间[(73.87±12.66)个月vs(75.11±13.68)个月]比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。结论 HPV18型感染与早期子宫颈腺癌患者的癌细胞转移有关，但其与患者的总生存时间、无瘤生存时间无明显相关性。

子宫颈腺癌；HPV基因型；预后；相关性

人乳头状瘤病毒(human papilloma virus，HPV)基因型与生殖道恶性肿瘤密切相关，其中HPV 18型感染是子宫颈癌发病的重要因素[1]。近年来，关于子宫颈腺癌预后影响因素的研究越来越多，多数研究都认为子宫颈腺癌的发生及预后均与HPV 18型密切相关，但近期也有学者提出HPV基因型与子宫腺癌预后并无关系[2]。本研究旨在明确HPV18型感染与子宫颈腺癌患者预后的相关性，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院在2000年1月至2011年1月期间收治的110例子宫颈腺癌患者作为研究对象。纳入标准：经病理检查确诊为子宫颈腺癌；FIGO (国际妇产科联盟)分期Ⅰ～Ⅱ期，且病理资料完整；行宫颈癌根治术进行治疗；无其他肿瘤病史。排除标准：病理资料不完整者；宫颈原位癌者；活检标本、蜡块受损或被污染者；蜡块组织过小或无肿瘤组织者。本组患者年龄26～71岁，平均(46.5±4.7)岁，孕次0～8次，平均(3.9±1.2)次。肿瘤类型：宫颈普通型腺癌50例，黏液性腺癌9例，腺鳞癌30例，子宫内膜样腺癌8例，浆液性腺癌4例，透明细胞癌4例，神经内分泌腺癌5例。所有患者均取肿瘤组织做HPV基因型检测。

1.2 试剂与仪器 石蜡组织DNA提取试剂盒(购自北京百泰克生物技术公司)、POWER PAC 200型电泳仪(购自美国Bio-Rad公司)、高速离心机(购自德国Eppendorf公司)、640-紫外分光光度仪(购自Beckman公司)、微量移液器(购自德国Eppendorf公司)、PCR引物设计(杭州浩基生物公司)、PCR引物合成(上海生工生物技术公司)。1.5%琼浆糖凝胶由0.3 g琼脂糖+20 mL TAE缓冲液配制而成。第一轮HPV18引物序列：正向5'-CACAGTTATGCACAGAGCTGC3'；反向5'-TATATTCATGCAATGTAGGTGTA3-'；第二轮HPV18引物序列：正向5'-CACTTCACTGCAAGACATAGA3-'；反向5-'GTTGTGAAATCGTCGTTTTTC A3-'。

1.3 HPV基因型检测方法

1.3.1 DNA提取 将石蜡组织切片(厚5 μm)，放入离心管(组织量≥20 mg)，加入二甲苯1 mL，离心后去除上层清液。加入无水乙醇离心5 min，去除上层清液。晾干加入磷酸盐缓冲液(PBS 200 μL)和溶液A (30 μL)，振荡，孵育0.5～1 h(65℃)，直至溶液变得澄清，再孵育1 h(90℃)。冷却至室温后加入结合液200 μL和异丙醇100 μL，颠倒混匀，转移到吸附柱中，离心后倒掉废液。加入抑制物去除液IR(500 μL)，离心30 s去除废液，再加入漂洗液WB(700 μL)，离心30 s去除废液。将吸附柱放置到空的收集管内，离心2 min去除漂洗液，再将吸附柱取出放置到离心管中，加入洗脱缓冲液50 μL，离心1 min。把离心后的溶液倒入吸附柱中，离心1 min，放置在2℃～8℃的环境中备检。

1.3.2 DNA质量检测 使用分光光度计测定DNA溶液在260 nm和280 nm下的OD值，测定的OD260/OD280值在1.8～2.0之间，说明DNA纯度较高，可用于HPV检测。

1.3.3 HPV检测 ①巢式PCR(聚合酶链式反应)。第一轮：使用引物HPVX-Reverse、HPVX-Forward (HPVX为HPV基因型，X代表68、59、58、56、52、51、45、39、35、33、31、18、16)。94℃反应2 min，94℃反应30 s+ 58℃反应30 s+68℃反应30 s为一个循环，共35个循环。第二轮：将上一轮获得的PCR产物作为反应模板，选用HPVX-R反向引物、HPVX-F正向引物做巢式PCR检测。94℃反应2 min，94℃反应30 s+55℃反应45 s+68℃反应30 s为一个循环，共30个循环。②电泳。108 g Tris+55 g硼酸+40 mL EDTA(0.5 mmol/L)配置成1 L的10倍TBE缓冲液。将溴乙锭加入琼脂糖凝胶溶液中，放置30 min使其凝固，然后放置到电泳槽中。在电泳槽中导入0.5倍TBE缓冲液直至液面超过凝胶面2 mm。量取8 μL的PCR反应产物和2 μL的缓冲液，混合后加入样孔，并加入DNA标记作为参照。将电泳仪电压设置为100 V进行电泳，待溴化乙锭染色后，在紫外分光光度仪下观察。电泳后，将凝胶去除，放置在图像分析系统中观察，通过比较已知DNA的碱基对长度来判定HPV基因型。

1.4 观察指标 收集所有患者的肿瘤最大径线、病理分化程度、临床分期、脉管内瘤栓、宫旁浸润、淋巴结转移等临床病理资料。电话随访至2016年3月，记录患者的总生存时间(术日至末次随访时间/死亡时间)、无瘤生存时间(术日至复发时间)。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，率的比较采用χ2检验，均以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HPV18型感染与病理特征的关系 本组110例宫颈腺癌患者中，HPV 18型阳性66例(60.00%)，从表1可知，HPV 18型阳性患者与阴性患者的FIGO分期、宫旁浸润情况比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，而HPV 18型阳性者的淋巴转移率、脉管瘤栓率明显高于阴性者，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 HPV18型感染与预后的关系 110例患者的5年无瘤生存率及总生存率分别为86.36%(95/110)和89.09%(98/110)。其中HPV 18型阳性患者的5年无瘤生存率及总生存率分别为86.36%(57/66)和87.88% (58/66)；HPV 18型阴性患者分别为86.36%(38/44)、90.91%(40/44)，组间比较差异均无统计学意义(χ2= 0.000、0.249，P＞0.05)。HPV 18型阳性患者与阴性患者的无瘤生存时间、总生存时间比较差异也均无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表1 HPV18型阳性与病理特征的关系[例(%)]

表2 HPV18型感染与预后的关系(±s)

表2 HPV18型感染与预后的关系(±s)

组别HPV18型阳性HPV18型阴性t值P值例数66 44无瘤生存时间(月) 63.54±10.54 65.01±12.41 0.667＞0.05总生存时间(月) 73.87±12.66 75.11±13.68 0.487＞0.05

3 讨 论

子宫颈癌是全球范围内发病率位居第三的妇科恶性肿瘤疾病，统计资料显示全球每年的子宫颈癌新增病例逾52万，死亡病例超过26万，给女性的生理健康造成了严重的危害[3]。目前，临床研究已明确子宫颈癌是由于高危型HPV持续感染所致。近期有文献报道子宫颈癌的发生与HPV感染有着密切联系，但是这类文献多以子宫颈鳞癌为研究对象，关于子宫颈腺癌与HPV感染相关性的研究相对较少。

有研究显示，宫颈腺癌患者HPV 18型的感染率为32%，并存在地区差异，在东南亚等地，子宫颈腺癌患者HPV 18型感染率更高[4]。本组研究结果显示宫颈腺癌患者HPV 18型阳性66例(60.00%)，这一结果与东南亚多国的文献报道结果相符[5]。近年来，陆续有文献报道HPV 18型感染是早期子宫颈癌预后不良的独立危险因素[6]。HPV 18型阳性宫颈神经内分泌癌患者的预后不良率明显高于阴性者[7]。还有文献报道Ⅰb期子宫颈癌患者中，HPV 18型阳性者的复发率比阴性者更高[8]。台湾也有研究显示，行手术治疗的早期子宫颈腺、鳞癌患者的预后与HPV 18型感染显著相关[9]。但是，也有研究结果显示子宫颈癌患者预后与HPV的负载量并无相关性。目前，关于子宫颈腺癌与HPV 18型感染相关性的研究报道较少，既有报道多认为HPV 18型感染与腺癌患者预后无明显相关性。有文献报道行手术治疗的早期子宫颈腺癌患者的5年生存率在60%～90%之间，无瘤生存率在68%～86%之间[10]。本次研究主要探讨了其与宫颈腺癌患者预后的相关性，结果显示，本组患者的5年无瘤生存率、总生存率分别为86.36%和89.09%，这一结果与上述文献结果基本相符。本次研究还显示HPV 18型阳性患者淋巴转移率、脉管瘤栓率明显高于阴性患者。说明HPV 18型感染与子宫颈腺癌患者的脉管内瘤栓、淋巴结转移相关。在预后方面，结果则显示HPV 18型阳性患者与阴性患者的无瘤生存时间、总生存时间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。说明HPV 18型感染与患者的总生存时间、无瘤生存时间无显著相关性。

综上所述，HPV 18基因型感染与子宫颈腺癌患者的癌细胞转移有关，但其与患者的总生存时间、无瘤生存时间无明显相关性。

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Correlation between HPV Type 18 and prognosis of patients with early adenocarcinoma of the cervix.

PAN Zai-xuan,CHEN Min.Department of Pathology,People's Hospital of Qionghai City,Qionghai 571400,Hainan,CHINA

Objective To discuss the correlation between the Human Papilloma Virus(HPV)Type 18 and early prognosis of patients with adenocarcinoma of the cervix.Methods One hundred and ten patients with adenocarcinoma of the cervix treated in People's Hospital of Qionghai City from Jan.2000 to Jan.2011 were selected as the study subjects.PCR was used to detect HPV genotype,and the correlation between HPV Type 18 and prognosis were analyzed. Results Among the 110 patients,66(60.00%)were detected with positive HPV Type 18.The lymph node metastasis, and vascular invasion rate of patients with positive HPV Type 18(27.27%,24.24%)were significantly higher than those of negative patients(6.82%,4.85%),P＜0.05.There were no significant differences in 5-year disease-free survival rate (86.36%vs 86.36%),5-year overall survival rate(87.88%vs 90.91%),disease-free survival time[(63.54±10.54)months vs(65.01±12.41)months]and overall survival time[(73.87±12.66)months vs(75.11±13.68)months]between the patients with positive HPV Type 18 and the negative patients(P＞0.05).Conclusion The genotype of HPV Type 18 infection is correlated with cancer cell metastasis of patients with adenocarcinoma of the cervix,but there is no obvious correlation between the overall survival and disease-free survival of the patients.

Adenocarcinoma of the cervix;HPV genotype;Prognosis;Correlation

R737.33

A

1003—6350（2016）17—2801—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.17.016

2016-03-07)

潘在轩。E-mail：zaixuanp@126.com