Ⅱ～Ⅲ期结肠癌患者DNA错配修复状态与其临床特征及预后的关系

王海霞，黄琰菁，王琳，陈俊民

(海南省人民医院肿瘤内科一区，海南 海口 570311)

Ⅱ～Ⅲ期结肠癌患者DNA错配修复状态与其临床特征及预后的关系

王海霞，黄琰菁，王琳，陈俊民

(海南省人民医院肿瘤内科一区，海南 海口 570311)

目的 分析Ⅱ～Ⅲ期结肠癌患者DNA错配修复(MMR)的状态与患者临床特征及预后的相关性。方法 选取2007年1月至2010年6月我院肿瘤内科收治的308例行肿瘤根治术Ⅱ～Ⅲ期结肠癌患者的组织标本，以免疫组织化学法检测MLH1、MSH2、MSH6、PMS2的表达，将其结果分为MMR缺失(dMMR)组及MMR完整(pMMR)组，比较两组患者的临床特征及预后，并采用Cox比例风险模型分析MMR状态与结肠癌预后的相关性。结果 本组结肠癌dMMR的发生率为20.8%(64/308)，pMMR为79.2%(244/308)。dMMR组患者中，年龄≤60岁、Ⅱ期、低分化癌、近端结肠癌及含黏液分泌癌患者的比例较pMMR组显著增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)。dMMR组患者的复发转移率及病死率分别为18.8%(12/64)、12.5%(8/64)，明显低于pMMR组的31.6%(77/244)、23.0%(56/244)，差异均有统计学意义(P＜0.05)；dMMR组患者的5年无病生存率及5年总生存率分别为82.8% (53/64)、87.5%(56/64)，明显高于pMMR组的69.3%(169/244)、77.0%(188/244)，差异均有统计学意义(P＜0.05)。经Cox比例风险模型分析结果提示，结肠癌MMR状态是影响患者无病生存时间及总生存时间的一个独立因素(P＜0.05)。结论 结肠癌不同MMR状态有着不同的临床特征，dMMR更多发生在年龄≤60岁、Ⅱ期、低分化癌、近端结肠癌及含黏液分泌癌的患者中，其可作为预测结肠癌预后较好的一个标志物。

结肠肿瘤；临床分期；DNA错配修复；预后

临床上结直肠癌患者中以直肠癌发病率为更高，但有报道显示，近年来结肠癌发病率的增长较迅速[1]。结肠癌行肿瘤根治性切除术仍是目前主要治疗手段，但Ⅱ～Ⅲ期结肠癌患者即使施行根治性切除后复发转移率仍为20%～50%[2]。近年来有报道提示，DNA错配修复(DNA mismatch repair，MMR)的状态与结肠癌预后存在着密切联系，而结肠癌中MMR缺失(defective DNA mismatch repair，dMMR)的患者有一定的临床特征[3]。本研究回顾性分析308例结肠癌患者不同MMR状态与临床特征及预后的相关性，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2007年1月至2010年6月我院收治的结肠癌308例患者，其中男性188例，女性120例；年龄37～79岁，平均(58.9±12.1)岁；Ⅱ期169例，Ⅲ期139例。入选标准：(1)肿瘤为原发性结肠癌；(2)均经病理诊断而确诊；(3)均行结肠癌根治切除术；(4)依据美国癌症联合委员会的分期标准均为Ⅱ～Ⅲ期；(5)手术前未行放化疗且未接受其他抗肿瘤的治疗方案；(6)随访资料完整；(7)不包括家族性腺瘤性息肉癌变的病例。

1.2MLH1、MSH2、MSH6、PMS2检测方法 以免疫组织化学法检测，所用试剂均为丹麦Dako公司生产，包括即用型MLH1、MSH2、MSH6、PMS2四种鼠抗人单克隆抗体，均严格按产品说明书要求进行操作。取患者术后保存结肠癌组织的蜡块，选择肿瘤细胞＞50%的区域进行取材，切片给予常规的脱蜡水化处理，以EDTA抗原修复液1 mmol/L(pH 8.0)给予高压热修复；再以H2O2(30 mL/L)孵育10 min后经蒸馏水冲洗，再以磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡5 min；将兔血清工作液滴加后孵育10 min；滴加一抗(MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)，于37℃恒温下孵育2 h，再以PBS行3次冲洗，3 min/次；滴加二抗后孵育15 min，再以PBS行3次冲洗，3 min/次；滴加三抗步骤同二抗；经二氨基联苯胺(DAB)显色，同时以苏木素复染，然后脱水、透明及封片。阴性对照以PBS代替一抗，阳性对照以正常的结肠黏膜上皮表达情况。

1.3 结果判定标准 MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均于细胞核定位，出现棕黄色或黄色颗粒则为表达阳性，计为(+)；细胞核不着色为表达缺失，计为(-)。MLH1、MSH2、MSH6、PMS2均表达为(+)判为MMR完整(pMMR)，而MLH1、MSH2、MSH6、PMS2中任意一种表达为(-)则判为dMMR[4]。

1.4 随访内容 (1)无病生存时间(DFS)：自手术后至肿瘤复发转移或任何原因致患者死亡的时间；(2)无病生存率；(3)总生存时间(OS)：自手术后至任何原因致患者死亡的时间；(4)总生存率。随访方法为门诊复诊及电话回访，随访时间截至2015年6月。

1.5 统计学方法 应用SPSS18.0统计软件进行数据分析，计数资料以百分数表示，组间比较采用χ2检验，计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间比较采用t检验，以Kaplan-Meier法及Log rank检验进行生存分析，以Cox比例风险模型进行单因素、多因素分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 结肠癌的MMR状态 本组结肠癌dMMR的发生率为20.8%(64/308)，pMMR为79.2%(244/ 308)。dMMR组中，36例患者为MLH1(-)MSH2(+) MSH6(+)PMS2(-)，13例患者为MLH1(+)MSH2(-) MSH6(-)PMS2(+)，8例患者为MLH1(+)MSH2(+) MSH6(+)PMS2(-)，2例患者为MLH1(+)MSH2(+) MSH6(-)PMS2(+)，2例患者为MLH1(+)MSH2(+) MSH6(-)PMS2(-)，1例患者为 MLH1(-)MSH2(-) MSH6(-)PMS2(-)，1例患者为 MLH1(-)MSH2(+) MSH6(-)PMS2(-)，1例患者为MLH1(+)MSH2(-) MSH6(+)PMS2(+)。结肠癌组织中MLH1(因MSH2、MSH6、PMS2与MLH1的细胞核染色结果一致，图片省略)的表达或缺失情况见图1、图2。

图1 结肠癌组织中MLH1表达阳性，免疫组化染色×400；

图2 结肠癌组织中MLH1表达阴性，免疫组化染色×400

2.2 两组患者的临床特征比较 dMMR组在年龄≤60岁、Ⅱ期、低分化癌、近端结肠癌及含黏液分泌癌各因素的发生比例较pMMR组显著增高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

2.3 两组患者的预后比较 dMMR组复发转移12例(18.8%)，死亡8例(12.5%)；pMMR组复发转移77例(31.6%)，死亡56例(23.0%)，差异均有统计学意义(χ2=7.309、5.098，P＜0.05)。dMMR组、pMMR组的5年无病生存率分别为82.8%(53/64)和69.3%(169/244)，5年总生存率分别为87.5%(56/64)和77.0%(188/244)，差异均有统计学意义(χ2=6.411、4.023，P＜0.05)。dMMR组的DFS、OS分别为(36.3±7.2)个月、(54.9±6.6)个月，而pMMR组分别为(22.5±5.9)个月、(30.6±4.9)个月，差异均有统计学意义(t=4.140、3.971，P＜0.05)。

2.4 结肠癌手术预后的影响因素 经统计学单因素分析结果提示，与结肠癌的复发转移明显相关的因素包括年龄、肿瘤的分化程度、临床分期、MMR的状态(P＜0.05)；而与结肠癌的死亡明显相关的因素包括年龄、肿瘤的分化程度、临床分期、治疗方式以及MMR的状态(P＜0.05)。经统计学多因素分析结果提示，影响结肠癌DFS的独立因素包括MMR状态、临床分期以及肿瘤的分化程度(P＜0.05)，而影响结肠癌OS的独立因素包括MMR状态、临床分期、治疗方式以及肿瘤的分化程度(P＜0.05)，见表2和表3。

表1 两组患者的临床特征比较

表2 影响结肠癌预后的单因素分析

表3 影响结肠癌预后的多因素分析

3 讨 论

临床上尽管仍以TNM分期作为首要指标来判断结肠癌患者的预后，但有很多学者发现虽有着相同TNM分期的结肠癌患者但其预后可能差距甚远[5]。因此，为给结肠癌患者提供一个更合理个体化的治疗方案，急切需要临床上寻找其他更合适的标志物以指导患者术后所进行的辅助治疗。结肠癌患者群中约85%是因染色体不稳定(CIN)而导致肿瘤发生，另15%的结肠癌患者群则是因MMR缺陷所致。在DNA的复制过程中逃脱DNA聚合酶的错配碱基主要是靠MMR系统来进行修复，而以此对基因组维持其稳定性，避免细胞发生突变而间接抑制肿瘤产生。MMR基因(包括MLH1、MSH2、MSH6、PMS2)的修饰(如甲基化)或突变可致MMR发生缺失[6]。Sinicrope等[7]报道，相比pMMR的结肠癌患者，dMMR结肠癌患者的预后要更好，dMMR可作为一个判定结肠癌预后的生物学指标。也有报道提示，MMR状态在预测结肠癌的疗效方面与术后辅助化疗的获益有相关性，其中pMMR患者能在术后辅助化疗中获得更多益处，而dMMR患者的获益较少，且Ⅱ期结肠癌dMMR患者术后以氟尿嘧啶单药化疗还可使OS缩短[8]。

国内目前关于结肠癌dMMR患者的疗效及预后相关报道比较少。本研究我们通过检测MLH1、MSH2、MSH6、PMS2这4种抗体以判定MMR是否发生表达缺失，与以往文献仅以检测MLH1、MSH2的方案相比，能够发现更多单纯MSH6及PMS2发生表达缺失的dMMR人群。本研究中dMMR的发生率为20.8%不同，主要参照国外文献的标准[4]，仅将MLH1、MSH2、MSH6、PMS2这4种蛋白是否出现缺失来综合分析，并未对阳性表达即pMMR患者的强度进一步做分析。本研究结果显示，dMMR组患者在Ⅱ期(70.3%)、低分化癌(34.4%)、近端结肠癌(67.2%)及含黏液分泌癌(40.6%)各因素中的发生比例要较pMMR组(分别为50.4%、20.1%、46.3%、19.3%)显著增高，差异均有统计学意义；与国外研究结果相似[9]。但本研究显示，在我国结肠癌≤60岁的患者群中dMMR发生率更高(67.2%)，明显高于pMMR组的47.5%。而国外的报道结果提示结肠癌患者年龄的分布与发生dMMR的关系并不显著[10]，究其原因本研究未能排除遗传性非息肉性结肠癌患者，而该类结肠癌患者的发病年龄呈年轻化趋势且伴有dMMR[11]，另外有报道国人的结直肠癌发病年龄要比国外患者早8～10年[12]，均导致本研究的dMMR发生比例在≤60岁患者群中现在增高。本研究结果未见在性别构成、淋巴结清扫、治疗方式等因素中MMR状态存在差异。目前我国的医疗机构还未能开展对MMR状态进行常规检测，故可通过本研究提示的各临床特征来初步判定MMR的状态。

目前大多研究结果提示MMR的状态与结肠癌患者手术后的预后有相关性。Zaanan等[13]的报道结果提示，结肠癌患者经单纯根治切除术治疗的dMMR组5年无病生存率及5年总生存率分别为80%、85%，而pMMR组分别为56%、66%(P＜0.01)。本研究的结果与之相似，dMMR组的5年无病生存率、5年总生存率分别为82.8%、87.5%，而pMMR组分别为69.3%、77.0%，差异均有统计学意义(P＜0.05)；同时本研究增加对两组患者DFS、OS的比较，dMMR组的DFS、OS均pMMR组明显延长，差异均有统计学意义(P＜0.05)。可见结肠癌患者dMMR是预测患者术后有着相对较好预后的一个新的生物标志物，分析其原因可能为于显微镜下可见dMMR患者的肿瘤细胞周围有着丰富淋巴细胞浸润，通过一定的免疫反应而抑制肿瘤细胞的扩散及转移。Win等[14]对1 263例结肠癌患者回顾性分析其MMR状态，共268例患者发生dMMR，且单因素及多因素分析均提示发生dMMR是患者预后较好的因素且在Ⅱ、Ⅲ期患者群中更显著(P＜0.01)。本研究的单因素分析结果提示与结肠癌的复发转移、死亡均呈明显相关的因素为年龄、肿瘤的分化程度、临床分期、MMR的状态(P＜0.05)；而多因素分析显示，影响结肠癌DFS、OS的独立因素为MMR状态、临床分期以及肿瘤的分化程度(P＜0.05)，与上述文献报道相符。

综上所述，结肠癌不同MMR状态有着不同的临床特征，dMMR更多发生在年龄≤60岁、Ⅱ期、低分化癌、近端结肠癌及含黏液分泌癌的患者中，且5年无病生存率、5年总生存率均较pMMR患者升高，且DFS、OS明显延长，可作为预测结肠癌预后较好的一个标志物。

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Relationship between DNA mismatch repair status and its clinical features and prognosis in patients with stageⅡ/Ⅲ colon cancer.

WANG Hai-xia,HUANG Yan-jing,WANG Lin,CHEN Jun-min.First Department of Medical Oncology,People's Hospital of Hainan Provincial,Haikou 570311,Hannan,CHINA

Objective To analyze the relationship between DNA mismatch repair(MMR)and clinical features and prognosis in patients with stagesⅡ/Ⅲcolon cancers.Methods The tissue specimen of 308 patients with stageⅡ/Ⅲcolon cancer who underwent radical tumor resection in Department of Medical Oncology in our hospital from January 2007 to June 2010 were selected.The expression of MLH1,MSH2,MSH6 and PMS2 were detected by immunohistochemistry,which were divided into defective MMR(dMMR)group and complete MMR(pMMR)group.The clinical features and prognosis between the two groups were compared.Cox proportional hazard model was used to analyze the relationship between MMR status and prognosis of colon cancer.Results The incidence of colon cancer dMMR was 20.8%(64/308)in dMMR group,and 79.2%(244/308)in pMMR group.In dMMR group of patients,the proportion of patients within 60 years old,stageⅡ,poorly differentiated carcinoma,proximal colon and mucinous carcinoma were significantly increased compared with pMMR group(P＜0.05).The recurrence rate and mortality rate of patients in dMMR group were 18.8%(12/64),12.5%(8/64),respectively,which were significantly lower than those in pMMR group[31.6%(77/244),23.0%(56/244),P＜0.05].The 5 year disease-free survival rate and overall survival rate in dMMR group were 82.8%(53/64),87.5%(56/64),respectively,which were significantly higher than those in pMMR group[69.3%(169/244),77.0%(188/244),P＜0.05].Cox proportional hazard model analysis showed that MMR status was an independent factor that affected the disease-free survival and overall survival time of patients(P＜0.05). Conclusion Different MMR states of colon cancer have different clinical features,and dMMR is mostly occurred in patients within 60 years old,stageⅡ,poorly differentiated carcinoma,proximal colon and mucinous carcinoma.It can be used as a marker to predict the prognosis of colon cancer.

Colonic neoplasms;Clinical stage;DNAmismatch repair(MMR);Prognosis

R735.3+5

A

1003—6350（2016）17—2768—05

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.17.006

2016-04-18)

王海霞。E-mail：wanghaixia74@163.com