不同宫颈病变组织中TLR4、TLR9及其信号通路下游因子基因的表达变化

不同宫颈病变组织中TLR4、TLR9及其信号通路下游因子基因的表达变化

胡建芳1，季莹2，余敏敏2

(1淮安市妇幼保健院，江苏淮安223002；2南京市第二医院)

摘要：目的观察不同宫颈病变组织中Toll样受体(TLR)4、TLR9及其信号通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因的表达变化。方法接受妇科手术或宫颈活检术的患者共90例，根据手术或活检宫颈组织病理检查结果分为三组：正常组[高危型人乳头瘤病毒(HPV)阴性、未见上皮内病变]30例，宫颈上皮内瘤变(CIN)组(HPV阳性、CIN)30例(CINⅠ4例，CINⅡ9例，CINⅢ17例)，宫颈癌组(HPV阳性、宫颈癌)30例(病理分期ⅠA～ⅡA期12例、ⅡB～Ⅳ期18例)。采用实时荧光定量PCR法检测三组患者宫颈组织中的TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因。结果TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因在三组患者宫颈组织中均有表达，随着宫颈病变的进展，其表达量均逐渐上升，组间相比，P均<0.05。结论 TLR4、TLR9及其信号通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因表达量随子宫颈病变进展呈上升趋势，TLR4、TLR9及其信号通路参与并可能促进宫颈癌的发生和发展。

关键词：Toll样受体；Toll样受体信号通路；人乳头瘤病毒；高危型人乳头瘤病毒；宫颈肿瘤；宫颈上皮内瘤变；宫颈癌

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.021

中图分类号：R737.3文献标志码：B

基金项目：2014年江苏省南京市医学科技发展项目(YKK14154)。

收稿日期：(2015-06-12)

通信作者：余敏敏

高危型人乳头瘤病毒(HPV)长期和持续感染是宫颈癌的发病原因之一[1]。Toll样受体(TLR)参与机体先天性免疫，其在癌组织和正常组织中的表达是有差异的[2]。TLR的异常表达引起免疫紊乱可能导致HPV的持续感染，诱导肿瘤免疫微环境的形成，是宫颈癌发生及进展过程中的一个重要环节[3]。本研究对不同宫颈病变组织中TLR4、TLR9及其信号通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因的表达变化进行了观察，探讨其在宫颈癌发生、发展过程中的作用，为宫颈癌的早期诊断及免疫治疗提供理论依据。

1资料与方法

1.1 临床资料2013年1月～2014年5月在南京市第二医院和淮安市妇幼保健院接受妇科手术或宫颈活检术的患者共90例，年龄23～77岁。手术或活检宫颈组织病理检查结果：HPV阴性、未见上皮内病变30例(正常组：为子宫肌瘤或肌腺瘤行全子宫切除术患者)；HPV阳性、宫颈上皮内瘤变(CIN)30例(CIN组：CINⅠ4例，CINⅡ9例，CINⅢ17例)；HPV阳性、宫颈癌30例(宫颈癌组：病理分期ⅠA～ⅡA期12例、ⅡB～Ⅳ期18例)。90例患者术前未接受过化疗和放射治疗，并具有完整的临床资料和病理诊断资料，术后留取的宫颈组织标本急速冷冻在-80 ℃冰箱中。

1.2宫颈组织中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因检测方法

1.2.1仪器和试剂StepOnePlus实时定量PCR仪、SYBR GREEN PCR Master Mix和TRIzol(美国ABI公司)，RNA反转录试剂盒(大连宝生生物工程有限公司)，FRESCO17高速冷冻离心机(美国Thermo公司)，Rios5+Mieei-QB超纯水系统(美国Millipore公司)，微量加样器、组织匀浆机、分光光度计(德国Eppendorf公司)，MDF-38ZE超低温冰箱、DH6-9143B5-Ⅲ干燥箱(中国上海新苗医疗器械制造有限公司)。

1.2.2引物设计及合成根据GeneBank的数据，采用Primer Premier 5.0软件设计引物，委托南京锐真生物技术有限公司合成引物。TLR4上游引物为5′-AGACCTGTCCCTGAACCCTAT-3′，下游引物为5′-CGATGGACTTCTAAACCAGCCA-3′；TLR9上游引物为5′-CTGCCTTCCTACCCTGTGAG-3′，下游引物为5′-GGATGCGGTTGGAGGACAA-3′；NF-κB上游引物为5′-AACAGAGAGGATTTCGTTTCCG-3′，下游引物为5′-TTTGACCTGAGGGTAAGACTTCT-3′；IFN-γ上游引物为5′-TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA-3′，下游引物为5′-TCGCTTCCCTGTTTTAGCTGC-3′；β-actin上游引物为5′-AGTTGCGTTACACCCTTTC-3′，下游引物为5′-CCTTCACCGTTCCAGTTT-3′。

1.3统计学方法采用SPSS19.0统计软件。计量资料两组和多组间的比较分别用双尾t检验和ANOVA方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因在三组宫颈组织中均有表达，随着宫颈病变的进展，其表达量均呈逐渐上升趋势，四者在三组宫颈组织中的表达比较见表1。

表1　三组宫颈组织中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因的相对表达量比较

注：与正常组相比，*P<0.01，**P<0.05；与CIN组相比，△P<0.01。

宫颈癌组中，12例ⅠA～ⅡA期患者与18例ⅡB～Ⅳ期患者宫颈组织中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因表达量相比，P均﹥0.05，见表2。

表2　 不同病理分期宫颈癌患者宫颈组织中TLR4、TLR9、

3讨论

99%宫颈癌的发生与HPV感染有关[3]。HPV主要通过性接触传播。HPV致癌的风险与不同年龄和个体之间的自身免疫能力有着密切联系，免疫耐受和逃逸可能是HPV持续感染的关键[4]。固有免疫是机体抵御感染性疾病的第一道防线。TLR是天然免疫系统模式识别受体家族的重要成员之一，TLR7激动剂咪喹莫特被批准用于治疗尖锐湿疣，并已被建议用于治疗其他HPV相关性疾病[5]。TLR4可识别细菌的外部成分脂多糖[6]，通过MyD88激活NF-κB、IRF信号通路，导致IL、TNF-α及IFN-γ等细胞因子释放到胞外，调节宫颈癌细胞的增殖、凋亡及免疫逃逸等。TLR9可以特异性识别病毒DNA中非甲基化的CpG-DNA基序并与其结合，发生二聚化或多聚化，可同时激活细胞毒性T细胞和辅助T细胞，最后激活NF-κB、IRF等转录因子，它们可以导致促炎因子的释放[7]。本观察发现，宫颈组织中TLR4、TLR9、NF-κB、IFN-γ基因的表达随着宫颈病变的进展呈逐渐上升趋势。推测TLR4、TLR9及其信号通路下游因子NF-κB、IFN-γ参与并可能促进HPV感染的免疫调控，与HPV持续感染及宫颈癌的发生、发展有关。ⅠA、ⅡA期与ⅡB、Ⅳ期宫颈癌患者宫颈组织中TLR4、TLR9基因及其信号通路下游因子NF-κB、IFN-γ基因的表达量相比差异无统计学意义，可能与观察病例数偏少有关；也可能为HPV病毒负荷量逐渐升高，通过与宿主免疫系统的相互作用，过度激活TLR而致Treg和NK受抑制，进而呈现局部免疫功能异常抑制，免疫系统不能正常识别、清除HPV，使HPV感染持续存在，宫颈病变不断进展[8]。

参考文献：

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[3] Corusic A, Skrgatic L, Mahovlic V, et al. Cervical cancer as a public health issue-what next [J]. Coll Antropol, 2010,34(1): 301-307.

[4] Alemany L, de Sanjose S, Tous S, et al. Time trends of human papillomavirus types in invasive cervical cancer, from 1940 to 2007[J]. Int J Cancer, 2014,135(1):88-95.

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