miR-17-5p在宫颈癌组织中的表达变化及其对宫颈癌细胞生长增殖影响

miR-17-5p在宫颈癌组织中的表达变化及其对宫颈癌细胞生长增殖影响

魏倩，张鹏

(天津医科大学肿瘤医院暨国家肿瘤临床医学研究中心及天津市肿瘤防治重点实验室,天津300060)

摘要：目的观察miR-17-5p在宫颈癌组织中的表达变化及其对宫颈癌细胞生长和增殖的影响。方法用实时荧光定量PCR法对20例宫颈癌患者的癌组织和癌旁组织中的miR-17-5p进行检测。将人宫颈癌细胞株HeLa分组，分别转染人工构建的miR-17-5p质粒、阴性对照质粒、miR-17-5p的反义寡核苷酸质粒及无关序列寡核苷酸质粒，采用MTT法和平板克隆形成实验检测细胞生长活性和克隆数目。结果宫颈癌组织、癌旁组织中miR-17-5p的相对表达量分别为0.315±0.185、1.143±1.373，两者相比，P<0.05。与转染阴性对照质粒的HeLa细胞相比，转染miR-17-5p质粒的HeLa细胞生长活性、克隆形成率明显降低(P均<0.05)；与转染无关序列寡核苷酸质粒的HeLa细胞相比，转染miR-17-5p的反义寡核苷酸质粒的HeLa细胞生长活性、克隆形成率明显升高(P均<0.05)。结论 宫颈癌组织中miR-17-5p表达减少，其可抑制宫颈癌细胞的生长和增殖。

关键词：多顺反子miRNA基因；miR-17-5p基因；宫颈肿瘤；宫颈癌；宫颈癌细胞；细胞生长；细胞增殖

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.003

中图分类号：R737.33 文献标志码：A

基金项目：天津医科大学肿瘤医院科学研究基金资助项目(Y1207)。

作者简介：第一魏倩(1987-)，女，硕士研究生，检验技师，主要研究方向为分子生物学及临床检验诊断。E-mail： weiqian19870729@163.com

作者简介：通信张鹏(1956-)，男，教授，主任技师，主要研究方向为临床检验诊断。E-mail： laopang.56@163.com

收稿日期：(2015-07-06)

Expression changes of miR-17-5p in cervical cancer tissues and its

effects on cervical cancer cell growth and proliferation

WEIQian,ZHANGPeng

(TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,NationalClinicalResearchCenterofCancer,

KeyLaboratoryofCancerPreventionandTherapy,Tianjin300060,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the expression changes of miR-17-5p in the cervical cancer tissues and its effects on cervical cancer cell growth and proliferation. MethodsThe levels of miR-17-5p in cervical cancer tissues and adjacent tissues of 20 patients were detected by real-time quantitative PCR. We divided the human cervical cancer cell line HeLa into different groups, which were respectively transfected by artificial miR-17-5p plasmid, negative control plasmid, miR-17-5p antisense oligonucleotide (ASO) plasmid and irrelevant sequence oligonucleotide plasmid. MTT and colony experiment were used to detect the growth activity and clone number.ResultsThe relative expression of miR-17-5p in the cervical cancer tissues and adjacent tissues were 0.315±0.185 and 1.143±1.373 (P<0.05). The cell growth and cloning efficiency of HeLa cells transfected with pri-miR-17-5p were significantly decreased as compared with those of HeLa cells transfected by negative control plasmid (all P<0.05); the cell growth and cloning efficiency of HeLa cells transfected with pri-miR-17-5p ASO were significantly increased as compared with those of HeLa cells transfected by irrelevant sequence oligonucleotide plasmid (all P<0.05). Conclusion The expression of miR-17-5p was significantly down-regulated in the cervical cancer tissues, which inhibited the cell growth and proliferation of cervical cancer cells.

Key words: polycistronic mRNA; miR-17-5p gene; cervical neoplasms; cervical carcinoma; cervical carcinoma cells; cell growth; cell proliferation

miR-17-5p在不同肿瘤组织中的表达水平是不同的，在多种恶性实体瘤如肺癌、胃癌及肝癌等肿瘤中呈过表达[1～3]，而在乳腺癌和鼻咽癌等肿瘤中因该基因簇所在染色体区段的杂合性缺失导致其呈低表达[4]。上述研究结果表明miR-17-5p在不同肿瘤的发生发展过程中扮演了不同的生物学角色[5]。2014年1月，我们对miR-17-5p在宫颈癌组织中的表达变化及其对宫颈癌细胞生长和增殖的影响进行了观察。现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1标本、细胞及试剂来源经病理学检查确诊的人宫颈癌组织及其对应正常宫颈组织标本各20例份、人宫颈癌细胞株HeLa、pcDNA3/pri-miR-17-5p质粒及其阴性对照质粒pcDNA3由天津医科大学生命科学实验中心提供。miR-17-5p的反义寡核苷酸(ASO-miR-17-5p)序列为5′-CUACCUGCACUGUAA-GCACUUUG-3′，其无关序列寡核苷酸(NC-ASO)序列为5′-GTGGATATTGTTGCCATCA -3；ASO-miR-17-5p质粒及NC-ASO质粒(即ctrl质粒)购自美国Integrated DNA Technology公司。荧光定量PCR的miR-17-5p引物购自北京奥科生物技术有限公司。转染试剂LipofectamineTM2000 购自美国Invitrogen 公司。反转录酶购自美国Promega公司。实时荧光定量PCR的2×SYBR Green Master Mix 购自日本Takara公司。GAPDH 多克隆抗体以及羊抗兔二抗购自天津赛尔生物技术有限公司。

1.2宫颈癌及癌旁组织中miR-17-5p的检测采用实时荧光定量PCR法。TRIzol提取受检组织中的RNA(紫外分光光度计检测OD260/OD280为1.8～2.0)，逆转录制备cDNA，然后进行PCR。PCR扩增引物反应体系为2×SYBR Premix Ex Taq酶10.0 μL，加入PCR Forward Primer及PCR Reverse Primer各1 μL,同时加入模板(CDNA)2 μL，补反应体系至20 μL；循环94 ℃ 4 min，共40个循环。以2-ΔΔCt表示目的基因的相对表达量，ΔΔCt=(Ct1-Ct2)-(Ct3-Ct4)，Ct1为处理样品待测基因(miR-17-5p)的临界循环数，Ct2为处理样品持家基因(U6)的临界循环数，Ct3为对照样品待测基因(miR-17-5p)的临界循环数，Ct4为对照样品持家基因(U6)的临界循环数。

1.3HeLa细胞培养、miR-17-5p基因转染及封闭测试①细胞培养：HeLa细胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液在 5% CO2、37 ℃孵箱中培养。基因转染前的第1天将细胞接种到6孔板的培养板中。②基因转染测试：取HeLa细胞，分为pcDNA3/pri-miR-17-5p组及其对照组(pcDNA3组)、ASO-miR-17-5p组及其对照组(ctrl组)。各组细胞接种于24孔板，每组3个复孔，培养24 h，细胞贴壁后上每组每孔分别转染1 μg的pcDNA3/pri-miR-17-5p、pcDNA3、ASO-miR-17-5p、ctrl质粒。48 h后TRIzol法提取各组受检细胞中的RNA，紫外分光光度计检测OD260/OD280为1.8～2.0，逆转录制备cDNA，然后进行PCR扩增，具体方法及结果计算同“1.2”。结果显示，与pcDNA3组相比， pcDNA3/pri-miR-17-5p组HeLa细胞中miR-17-5p表达水平提高约1.5倍；ASO-miR-17-5p组HeLa细胞中miR-17-5p的表达水平降低为ctrl组的30%左右。上述结果表明miR-17-5p基因可成功转染进入HeLa细胞，HeLa细胞中的miR-17-5p基因也可成功被封闭，可进行后续实验。

1.4miR-17-5p基因转染及封闭后HeLa细胞生长情况观察①miR-17-5p基因转染及封闭后HeLa细胞吸光度值(A值：反映细胞活性)检测：采用MTT法检测HeLa细胞A值。HeLa细胞传代培养第2天、密度达70%～80%时,取对数生长期、状态良好的细胞接种于96孔板，分四组(同“1.3”)，每组设3个复孔，同时设24、36、72 h三个时间点。pcDNA3/pri-miR-17-5p组、pcDNA3组、ASO-miR-17-5p组、ctrl组每孔分别转染0.15 μg的pcDNA3/pri-miR-17-5p、pcDNA3、ASO-miR-17-5p、ctrl质粒。于三个时间点分别取出培养板，每孔加MTT 10 μL，置37 ℃、5% CO2孵箱中培养4 h；取出培养板，2 000 g离心5 min，弃上清，每孔加100 μL的DMSO终止反应并溶解甲臜蓝紫色颗粒，避光震荡混匀5 min，分光光测度计测波长570 nm处的A值。②miR-17-5p基因转染及封闭后HeLa细胞集落形成观察：采用平板克隆实验。HeLa细胞培养第2天、密度达到80%时,取对数生长期、状态良好的细胞接种于48孔板中，分四组(同“1.3”)，每组设3个复孔。pcDNA3/pri-miR-17-5p组、pcDNA3组、ASO-miR-17-5p组、ctrl组每孔分别转染0.5 μg的pcDNA3/pri-miR-17-5p、pcDNA3、ASO-miR-17-5p、ctrl质粒。转染后36 h，弃原培养液，用1×PBS浸洗1次，消化液消化，加入含有10% FBS(不含抗生素)的培养液，终止消化并吹打成细胞悬液。调整细胞密度后接种于12孔板，并设置最终细胞数为100/孔，于37 ℃、5% CO2孵箱中培养。培养期间，每3 d更换1次培养液，以细胞数≥50个作为集落形成的标准，直至12孔板中集落之间发生互相融合后结束计数。细胞集落形成率=(细胞集落数/初始接种细胞数)×100%。

1.5统计学方法采用SPSS13.0统计软件。计量资料两两比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1宫颈癌及癌旁组织中miR-17-5p的表达比较宫颈癌组织中miR-17-5p的相对表达量为0.315±0.185，癌旁组织为1.143±1.373，两者相比，P<0.05。

2.2各组HeLa细胞A值比较不同时间点各组HeLa细胞A值比较见表1。表1表明,miR-17-5p可以抑制HeLa细胞的生长活性。

表1　不同时间点各组HeLa细胞A值比较

注：与pcDNA3组相比，*P<0.05；与ctrl组相比，#P<0.05。

2.3各组HeLa细胞集落形成率比较pcDNA3/pri-miR-17-5p组、pcDNA3组的HeLa细胞集落形成率分别为15%±2%、29%±2%，两组相比，P<0.05；ASO-miR-17-5p组、ctrl组HeLa细胞的集落形成率分别为37%±1%、23%±1%，两组相比，P<0.05。表明miR-17-5p可以抑制HeLa细胞的增殖。

3讨论

miR-17-92是一个典型的多顺反子miRNA基因簇。在人类基因组中, miR-17-92位于染色体13q31.3上一个约长7 kb的初级转录本C13orf25的第3个内含子上，编码6个成熟miRNA，包括miR-17-5p。这些miRNA的序列和组成在所有脊椎动物中是高度保守的，但在不同的肿瘤发生发展过程中具有不同的生物学功能[6]。编码miR-17-92簇的基因组位点在大B细胞淋巴瘤、滤泡淋巴瘤等多种肿瘤中出现扩增，导致其在这些肿瘤中高表达[7]。此外，miR-17-92簇在血液系统肿瘤和多种恶性实体瘤中同时存在过表达[1～3]。从上述研究结果可以看出,miR-17-92在细胞的生命活动中发挥了癌基因的作用。Tagawa等[8]研究指出，miR-17-92与C-myc的表达密切相关，miR-17-92和C-myc都能调控细胞周期转录因子E2F1，说明原癌基因myc-E2F1转录激活了miR-17-92簇。另一方面，miR-17-92簇又能负性调控E2F1的活性，抑制细胞周期进展，反馈抑制了C-myc促进细胞增殖的作用，由此认为其又具有潜在的抑癌作用。除此之外，miR-17-92还可以抑制细胞凋亡和细胞衰老，同时对新生血管的形成和肿瘤的转移有促进作用[9]。

本研究发现，miR-17-5p在宫颈癌组织中的表达明显低于癌旁组织，提示miR-17-5p可能在宫颈癌的发生中扮演抑癌基因的角色。

为了研究miR-17-5p在宫颈癌细胞中的生物学作用，我们将pcDNA3/pri-miR-17-5p质粒转染宫颈癌细胞HeLa，提高了其miR-17-5p表达水平，结果HeLa细胞生长活性明显减低，细胞集落形成能力明显受抑制。表明在宫颈癌细胞中的miR-17-5p具有抑制细胞生长活性和增殖的作用，进一步证实miR-17-5p在宫颈癌中发挥了抑癌基因的角色。

原癌基因和抑癌基因的表达水平发生失调性的改变对于所有肿瘤的发生发展起着重要作用[10,11]。miRNA的异常表达已经在肿瘤的恶性发生发展及转化过程中发挥了重要作用，成为了一种新型的肿瘤诊断和治疗的候选靶点[12,13]。我们推测miR-17-5p的抑制细胞生长和增殖的作用是通过对其靶基因的表达进行转录后水平的调控，影响靶基因的表达水平，从而调节下游的各生物学过程。

参考文献：

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