三七总皂苷对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8脑组织中NF-κB/p50表达的影响

三七总皂苷对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8脑组织中NF-κB/p50表达的影响

黄金兰1，吴登攀1，景鑫2，田新2，钟振国2

(1徐州医学院，江苏徐州221004；2广西中医药大学)

摘要：目的观察三七总皂苷(PNS)对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8脑组织中大脑转录因子NF-κB/p50表达的影响。方法将60只SAMP8随机分为对照组、PNS高剂量组、PNS低剂量组、石杉碱甲(Huperzine A)组，每组15只。PNS高、低剂量组分别给予PNS 200 mg/kg、100 mg/kg灌胃，Haperzine A组给予Huperzine A 0.03 mg/kg灌胃，对照组给予相同容积生理盐水灌胃，均每天1次，连续给药2个月。灌胃结束后，取小鼠脑组织。分别采用real-time PCR技术、Western blotting、免疫组化法检测小鼠脑组织中的NF-κB/p50 mRNA、NF-κB/p50 蛋白、NF-κB/p50阳性细胞。结果PNS高剂量组、PNS低剂量组、Huperzine A组、对照组NF-κB/p50 mRNA的相对表达量分别为1.61±0.05、1.72±0.19、1.36±0.24、1.85±0.08；PNS高剂量组与对照组相比，P<0.05；Huperzine A组与对照组相比，P<0.01。PNS高剂量组、PNS低剂量组、Huperzine A组、对照组NF-κB/p50 蛋白的相对灰度强度分别为0.696±0.029、0.910±0.038、1.315±0.014、1.436±0.025；PNS高剂量组、PNS低剂量组对照组相比，P均<0.01；Huperzine A组与对照组相比，P<0.05。PNS高剂量组、PNS低剂量组、Huperzine A组、对照组NF-κB/p50阳性细胞数分别为(35±6)、(5±7)、(63±4)、(71±11)个/HP；PNS高剂量组、PNS低剂量组与对照组相比，P均<0.01；Huperzine A组与对照组相比，P<0.05。结论 PNS能降低SAMP8脑组织中NF-κB/p50 mRNA和蛋白的表达，可能是其下调淀粉样前体蛋白基因表达的作用机制。

关键词：三七总皂苷；快速老化痴呆模型小鼠SAMP8；核转录因子；动物实验

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.010

中图分类号：R743.9；R912文献标志码：A

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81460598)；江苏省新药与临床药学重点实验室开放研究课题(ZR-XY201402)；江苏省教育厅开放研究课题(KJS1404)；徐州医学院优秀人才科研启动基金资助项目(D2014017)。

收稿日期：(2015-07-14)

通信作者：钟振国

淀粉样前体蛋白(APP) 是一类与阿尔茨海默病(AD)的发生发展密切相关的Ⅰ型跨膜蛋白，其淀粉源途径可以生成完整的β淀粉样蛋白(Aβ)，因此，APP基因的过表达与Aβ的产量及AD的神经病理改变可能有关[1]。APP基因5端调控区有核转录因子NF-κB/Rel家族中调节因子的特异性结合部位(即APPκB结合位点)，由NF-κB家族成员p50参与构成的复合物可与APPκB结合位点特异性结合而激活APP基因的转录。我们的前期研究[2]结果表明,三七总皂苷(PNS)在转录水平上可以下调APP的表达。2013年7月，我们通过实验观察了PNS对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8脑组织中大脑转录因子NF-κB/p50表达的影响，探讨PNS是否通过影响NF-κB/p50转录因子来调节APP mRNA的水平。

1材料与方法

1.1实验动物、主要试剂和仪器健康雄性快速老化痴呆模型小鼠SAMP8共60只，体质量20～30 g。PNS，石杉碱甲(Huperzine A)，NF-κB/p50抗体，β-actin， RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit，山羊抗兔IgG。DU-640型紫外分光光度计，定量PCR仪，转膜仪，电泳仪。

1.2实验动物分组、给药及标本采集将60只SAMP8随机分为对照组、PNS高剂量组、PNS低剂量组、Huperzine A组(阳性对照)，每组15只。PNS高、低剂量组分别给予PNS 200 mg/kg、100 mg/kg(用双蒸水调配)灌胃，Huperzine A组给予Huperzine A 0.03 mg/kg(用双蒸水调配)灌胃，对照组给予与相同容积的生理盐水灌胃，均每天1次，连续灌胃2个月。灌胃结束后，取小鼠大脑组织备检。

1.3SAMP8大脑组织中NF-κB/p50 mRNA的检测采用real-time PCR技术。TRIzol试剂盒提取受检大脑组织总RNA，紫外分光光度法测定RNA纯度和含量，按RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒说明书合成cDNA，然后进行PCR(NF-κB/p50上游引物为5′-GCCCCGGCATCC ACC ATG G-3′、下游引物为5′-CAGCTCTGTGGCGCTGGCTT-3′，β-actin上游引物为5′-GCGACGAGGCCCAGAGCAAG-3′、下游引物为5′-GGGGCCACACGCAGCTCATT-3′)： 95 ℃预热变性5 min、95 ℃变性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共进行40个循环后，72 ℃延伸5 min。NF-κB/p50 mRNA的相对表达量以NF-κB/p50 mRNA Ct值与β-actin mRNA Ct值的比值表示。

1.4 SAMP8大脑组织中NF-κB/p50 蛋白的检测采用Western bloting。受检大脑组织裂解、匀浆后转移至EP管，离心、取上清，BCA法检测NF-κB/p50 蛋白。对已提取的NF-κB/p50蛋白进行电泳和转膜等处理，ECL显色后，扫描条带，并用Quantity One 4.62分析软件将图片上的每条特异条带灰度值数字化。

1.5SAMP8大脑组织中NF-κB/p50阳性细胞检测及计数采用免疫组化法。SAMP8大脑组织经石蜡包埋、切片等处理后，免疫组化法染色，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明、封片。高倍镜下(40×)镜检，随机选取大脑顶叶皮层、海马周围连续5个视野，计数5个视野NF-κB/p50阳性细胞，计算每个样本的平均阳性细胞个数。统计时将组内所有样本的平均阳性细胞数相加再计算出均值代表该组的平均阳性细胞数。

1.6统计学方法采用SPSS11.5统计软件。计量资料比较用t检验及方差分析(两两比较用SNK法)。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1各组SAMP8大脑组织NF-κB/p50 mRNA表达比较PNS高剂量组、PNS低剂量组、Huperzine A组、对照组NF-κB/p50 mRNA的相对表达量分别为1.61±0.05、1.72±0.19、1.36±0.24、1.85±0.08；PNS高剂量组与对照组相比，P<0.05；Huperzine A组与对照组相比，P<0.01。

2.2各组SAMP8大脑组织NF-κB/p50 蛋白表达(图1)比较PNS高剂量组、PNS低剂量组、Huperzine A组、对照组NF-κB/p50 蛋白的相对灰度强度分别为0.696±0.029、0.910±0.038、1.315±0.014、1.436±0.025；PNS高剂量组、PNS低剂量组与对照组相比，P均<0.01；Huperzine A组与对照组相比，P<0.05。

2.3各组SAMP8大脑组织NF-κB/p50 阳性细胞数比较PNS高剂量组、PNS低剂量组、Huperzine A组、对照组NF-κB/p50阳性细胞数分别为(35±6)、(5±7)、(63±4)、(71±11)个/HP；PNS高剂量组、PNS低剂量组与对照组相比，P均<0.01；Huperzine A组与对照组相比，P<0.05。

注：1为对照组；2为Huperzine A组；3为PNS高剂量组; 4为PNS低剂量组。

图1各组NF-κB/p50蛋白表达

3讨论

在AD患者大脑中的特定区域APP基因转录水平升高，家族性AD患者大脑中的成纤维细胞APP基因转录水平也显著升高。大量表达的APP经过一系列蛋白水解酶裂解，生成大量含39～43个氨基酸残基的Aβ片段，最终形成老年斑[3]。

NF-κB是一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子序列特异性结合的核蛋白因子，也是Rel蛋白家族成员，参与基因尤其是与机体免疫反应有关基因的表达调控[4]。已在哺乳动物细胞中发现NF-κB/Rel家族有5个成员，分别是NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、RelA(p65)、C-Rel和Rel-B。在APP基因5端调控区有APPκB结合位点，由p50参与构成的复合物可与该位点特异性结合而激活APP转录。

我们的前期研究[2]证实PNS在转录水平上可以下调APP的表达。本研究发现，与对照组相比，PNS高剂量组的NF-κB/p50 mRNA表达降低，PNS高、低剂量组的NF-κB/p50 蛋白表达降低且阳性细胞数减少。提示PNS能下调SAMP8大脑组织NF-κB/p50 mRNA和蛋白的表达。Huperzine A可改善多种认知功能缺陷动物的学习和记忆功能，在我国已用于AD的治疗[5]。本研究结果表明，Huperzine A亦可下调SAMP8大脑NF-κB/p50 mRNA和蛋白的表达。推测PNS有可能通过降低转录因子NF-κB/p50水平而下调APP mRNA的表达。

参考文献：

[1] Soldano A, Hassan BA. Beyond pathology: APP, brain development and Alzheimer′s disease [J]. Curr Opin Neurobiol, 2014,27(6):61-67.

[2] 钟振国,吕良,柴立民,等.三七总皂苷对快速老化模型小鼠SAMP8脑内APP基因转录的影响[J].中药材,2011,34(1):77-80.

[3] Shahani N, Seshadri S, Jaaro-Peled H, et al. DISC1 regulates trafficking and processing of APP and Aβ generation [J]. Mol Psychiatry, 2015,20(7):874-879.

[4] Pateras I, Giaginis C, Tsigris C, et al. NF-κB signaling at the crossroads of inflammation and atherogenesis: searching for new therapeutic links [J]. Expert Opin Ther Targets, 2014,18(9):1089-1101.

[5] Qian ZM, Ke Y. Huperzine a: is it an effective disease-modifying drug for Alzheimer′s disease[J]. Front Aging Neurosci, 2014,6(4):216.