表观遗传修饰肿瘤细胞疫苗皮下注射对仓鼠胰腺癌的抗肿瘤效应

表观遗传修饰肿瘤细胞疫苗皮下注射对仓鼠胰腺癌的抗肿瘤效应

张海峰1,2，曹维2，周国雄2，陈海琴2，陈卫昌1

(1苏州大学附属第一医院，江苏苏州215006；2南通大学附属医院)

摘要：目的观察表观遗传修饰的肿瘤细胞疫苗皮下注射后对仓鼠胰腺癌皮下移植瘤的抗肿瘤效应。方法通过皮下注射N-亚硝基双-2-氧丙基建立仓鼠胰腺癌模型，将仓鼠胰腺肿瘤取出、切碎，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肿瘤组织移植在健康仓鼠的腹股沟皮下，建立仓鼠皮下移植瘤模型。采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂和甲基化转移酶抑制剂表观遗传修饰胰腺癌PANC-1细胞，构建肿瘤细胞疫苗，同时构建对照细胞疫苗。将12只荷移植瘤仓鼠随机分为疫苗注射组和对照组(各6只)，疫苗注射组皮下注射肿瘤细胞疫苗，对照组皮下注射对照细胞疫苗。荷移植瘤仓鼠于第4周统一处死，观察两组肿瘤生长情况及瘤组织中环氧合酶2(COX-2)、5脂氧合酶(5-LOX)、半乳凝素1(GAL-1)、半乳凝素3(GAL-3)、主要组织相容性复合体(MHC) Ⅰ、MHC Ⅱ的表达变化。结果疫苗注射组移植瘤大小随时间延长呈递减趋势，对照组移植瘤大小随时间延长呈递增趋势；疫苗治疗组肿瘤大小平均为0.39 cm、对照组为0.82 cm，两组相比，P<0.05；疫苗注射组移植瘤组织中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3的表达较对照组降低，而MHC Ⅰ、MHC Ⅱ表达较对照组升高，两组相比，P均<0.01。结论表观遗传修饰的肿瘤细胞疫苗皮下注射能有效延缓仓鼠胰腺癌移植瘤的生长，降低移植瘤组织中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3的表达，上调MHC Ⅰ、MHC Ⅱ的表达。

关键词：胰腺肿瘤；胰腺癌；胰腺癌PANC-1细胞株；肿瘤细胞疫苗；表观遗传修饰；免疫逃逸；动物实验

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.43.007

中图分类号：R576 文献标志码：A

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81072028)；江苏省创新团队医学领军人才项目(LJ201135)。

作者简介：第一张海峰(1974-)，男，博士在读，副主任医师，主要研究方向为胰腺疾病。E-mail： zhanghaifeng740702@126.com

作者简介：通信陈卫昌(1962-)，男，博士，教授，主任医师，主要研究方向为胰腺疾病。E-mail： weichangchen@126.com

收稿日期：(2015-09-09)

Anti-tumor effects of tumor cell vaccine by epigenetic modification on pancreatic cancer of hamster

ZHANGHai-feng1, CAO Wei, ZHOU Guo-xiong, CHEN Hai-qin, CHEN Wei-chang

(1TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Soochow215006,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the anti-tumor effects of tumor cell vaccine by epigenetic modification on pancreatic cancer of hamster through subcutaneous injection. MethodsThe hamster pancreatic cancer models were set up by subcutaneous injection of N-nitrosobis-2-oxopropylamin. We removed the pancreatic tumor, chopped, and took 0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm tumor tissue to transplant into groin skin of healthy hamsters, and then the hamster subcutaneous transplanted tumor models were set up. In addition, PANC-1 cells were treated by histone deacetylase inhibitors and methyl transferase inhibitor epigenetic modification to make the tumor cell vaccine. Meanwhile, the control cell vaccine was set up. Twelve hamster pancreatic cancer xenografts were divided into two groups, 6 in each group: the vaccinated group and the control group which were respectively treated with tumor cell vaccine and control cell vaccine by subcutaneous injection. The tumor growth and the expression of cyclooxyg enase-2 (COX-2), 5-LOX, GAL-1, GAL-3, MHC Ⅰ and MHC Ⅱ of the two groups were observed. Results In the vaccinated group, the tumor size (mean size 0.39 cm) was decreased with the prolonged time, but in the control group, the tumor size (mean size 0.82 cm) was increased with the prolonged time. Tumor size was statistical different between the two groups (P<0.05). The expression of COX-2, 5-LOX, GAL-1 and GAL-3 was lower in the vaccinated group as compared with that of the control group, and MHC Ⅰ, MHC Ⅱ expression was higher than that of the control group, the difference was statistically significant (all P<0.01). ConclusionThe epigenetic modification tumor vaccine can effectively delay the growth of transplanted tumor, reduce the expression of COX-2, 5-LOX, GAL-1 and GAL-3, and up-regulate the expression of MHC Ⅰ and MHC Ⅱ.

Key words: pancreatic neoplasms; pancreatic carcinoma; pancreatic carcinoma cell line PANC-1; tumor vaccine; epigenetic modification; immune escape; animal experiment

胰腺癌对放疗、化疗均不敏感。以肿瘤疫苗为基础的主动免疫治疗，由于其高效和安全的特点而成为近来研究的热点[1,2]。肿瘤疫苗利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性免疫反应，增强机体的抗肿瘤免疫反应能力，抑制肿瘤的生长和转移，以达到治疗肿瘤的目的。对肿瘤患者免疫系统本身来讲，即使肿瘤细胞表面表达特异性抗原，仍不能针对肿瘤细胞进行有效的攻击，即存在免疫逃逸现象。有研究[3,4]发现，胰腺癌细胞株PANC-1低表达主要组织相容性复合体(MHC) Ⅱ类分子以及共刺激分子是其免疫逃逸的重要机制之一，而MHC Ⅱ类反式激活因子(CIITA)表达阴性是胰腺癌细胞株PANC-1不能表达MHC Ⅱ类分子的关键原因。采用组蛋白去乙酰化酶抑制剂和甲基化转移酶抑制剂进行表观遗传处理能使PANC-1细胞的CIITA蛋白重新表达，同时上调MHC Ⅰ类及MHC Ⅱ类分子的表达，使其恢复免疫原性。2011年3月1日～4月28日，我们观察了表观遗传修饰的肿瘤细胞疫苗注射后对仓鼠胰腺癌皮下移植瘤的抗肿瘤效应。现将结果报告如下。

1材料与方法

1.1实验动物、细胞株和实验材料叙利亚黄金仓鼠，6～8周龄，雌性，体质量80 g左右，由南通大学实验动物中心提供。人胰腺癌细胞株PANC-1，购自中国科学院上海生命科学研究院。5-氮杂-2-脱氧核苷(5-Aza)购自美国Sigma-Aldrich公司，羟溩酸(SAHA)购自美国Cayman Chenmical公司，IFN-γ购自美国PeproTech公司，Mitomycin C购自瑞士Roche公司，N-亚硝基双-2-氧丙基(BOP)购自美国Santa Cruz Biotechnology，所有抗体购自美国santa cruz公司。

1.2仓鼠胰腺癌模型及仓鼠胰腺癌移植瘤模型的构建取实验用黄金仓鼠，BOP 10 mg/kg皮下注射，每周1次，连续注射8周，常规饲养，约36周建成仓鼠胰腺癌模型。将建模成功的仓鼠胰腺癌模型的胰腺肿瘤取出，无菌情况下仔细清除结缔组织，将肿瘤组织切碎，置生理盐水中备用。再取实验用健康仓鼠，于仓鼠腹股沟处皮肤做一长约0.5 cm的切口，游离皮下组织，取上述切碎的胰腺肿瘤组织0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，移植至腹股沟游离区皮下，缝合切口，日光灯照射10 min。于普通环境中饲养仓鼠，皮下移植瘤长径>0.5 cm后即为仓鼠胰腺癌移植瘤模型构建成功。

1.3表观遗传修饰肿瘤细胞疫苗及对照细胞疫苗的制备收集对数生长期的胰腺癌细胞株PANC-1，接种于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中孵育。待细胞贴壁(约12 h)后换液，加入10 μM的5-Aza，培养箱中孵育24 h后重复给予10 μM的5-Aza，再孵育24 h后换液，加入0.5 μM的SAHA 0.5 μM，培养箱中孵育24 h后加入1 000 U/mL的IFN-γ，培养箱中孵育48 h后予以0.25%胰酶消化，800 r/min离心5 min，去除EDTA。PBS重悬细胞，计数并调整细胞密度为1×107/mL。加入125 μg/mL的丝裂霉素c (MMC)，37℃、5% CO2培养箱中孵育2 h，期间每20 min轻轻震摇1次。800 r/min离心5 min，去除上清，PBS重悬。重复上一步骤2次，去除MMC。计数并调整细胞密度为2×107/mL，此为表观遗传修饰肿瘤细胞疫苗，将其装入EP管中,4 ℃保存备用。

收集对数生长期的胰腺癌细胞株PANC-1，接种于含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM完全培养基中，37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中孵育后予0.25%胰酶消化，800 r/min离心5 min，去除EDTA。PBS重悬细胞，计数并调整细胞密度为1×107/mL，加入125 μg/mL的MMC，37 ℃、5%CO2培养箱中孵育2 h，期间每20 min轻轻震摇1次。800 r/min离心5 min，去除上清，PBS重悬。重复上一步骤2次，去除MMC。计数并调整细胞密度为2×107/mL，此为对照细胞疫苗，将其装入EP管中，4 ℃保存备用。

1.4荷移植瘤仓鼠的疫苗注射及移植瘤的生长观察将荷胰腺癌移植瘤仓鼠12只随机分为疫苗治疗组和对照组，各6只。疫苗治疗组：将表观遗传修饰肿瘤细胞疫苗注射在距离移植瘤1 cm处的皮下，每周1次。对照组：将对照细胞疫苗注射在距离移植瘤1 cm处皮下，每周1次。每7 d测1次肿瘤长径a及横径b(移植瘤为类球形，取其中心作长轴及纵轴，测量其长度，分别代表a、b)，肿瘤大小用(a+b)/2表示。绘制皮下移植瘤生长曲线。计算抑瘤率，抑瘤率=(1-疫苗治疗组肿瘤大小/对照组肿瘤大小)×100%。4周后统一处死两组仓鼠，将移植瘤取出，检测瘤组织中的环氧合酶2(COX-2)、5脂氧合酶(5-LOX)、半乳凝素1(GAL-1)、半乳凝素3(GAL-3)、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ。

1.5移植瘤组织中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ mRNA及蛋白的检测COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHCⅠ、MHC Ⅱ mRNA检测采用Real-time PCR。根据GeneBank提供的COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHCⅠ、MHCⅡ(HLA-DRA)以及β-action全长cDNA序列，经Primer5.0软件设计引物，再过Blast进行同源性检索后，由上海invitrogen公司合成引物：COX-2上游引物为5′-CTGTATCCCGCCCTGCTGGTG-3′、下游引物为5′-CACTTGCGTTGATGGTGGCTGTCTT-3′，5-LOX上游引物为5′-TGGCATCTAGGTGCAGTGTG-3′、下游引物为5′-CCTCCAGGTTCTTGCGGAAT-3′，GAL-1上游引物为5′-AATCATGGCCTGTGGTCTGG-3′、下游引物为5′-GAAGCGGGGGTTGAAGTGTA-3′，GAL-3上游引物为5′-TATCCTGCTACTGGCCCCTT-3′、下游引物为5′-AAGTGGAAGGCGATGTCGTT-3′，MHC Ⅰ上游引物为5′-GGAGGATTTACTGGGCGCTT-3′、下游引物为5′-AAGTGGAAGGCGATGTCGTT-3′，MHC Ⅱ上游引物为5′-TATGTGCCCACACAAAGGAGG-3′、下游引物为5′-CTGTCAGGAGCAGCGCTAAG-3′，β -actin上游引物为5′-TTGTCACCAACTGGGACGATATGG-3′、下游引物为5′-CGACCAGAGGCATACAGGGACAAC-3′。PCR反应条件为95 ℃预变性3 min、95 ℃变性40 s、54 ℃复性40 s、72 ℃延伸40 s，扩增40个循环。进行Melting curve分析，所得Ct值按照ΔΔCt 值法进行表达量分析，以目的基因mRNA和β-actin mRNA含量的比值表示目的基因的相对表达量。

COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHCⅠ、MHC Ⅱ蛋白检测采用免疫印迹法。将新鲜胰腺癌组织制备匀浆，蛋白定量，取50 μg蛋白常规行蛋白质印迹，以β-actin作内参。最后ECL发光，X线片曝光、显影。采用Quantity One4.0图像分析软件进行扫描分析，以目的条带与内参条带的灰度值比表示目的蛋白的相对表达量。

1.6统计学方法采用SPSS11.5统计软件。计量资料多组间比较用单因素方差分析，两组比较用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组移植瘤大小比较疫苗治疗组给予表观遗传修饰肿瘤细胞疫苗注射后移植瘤逐渐缩小，移植瘤体积在各时间点均小于对照组，两组仓鼠移植瘤生长曲线见图1。疫苗治疗组肿瘤大小平均为0.39 cm、对照组为0.82 cm(第4周)，两组相比，P<0.05；疫苗治疗组抑瘤率为52.43%。

图1　仓鼠移植瘤生长曲线

2.2两组移植瘤组织COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ mRNA及蛋白的表达比较疫苗治疗组移植瘤组织中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ mRNA相对表达量分别为11.030±0.801、4.403±0.176、16.980±0.135、43.850±0.566、84.730±0.445、7.868±0.229，对照组分别为29.080±1.244、16.740±0.145、34.720±1.242、76.530±0.562、43.880±0.179、4.500±0.266，两组各指标相比，P均<0.01。与对照组相比，疫苗治疗组仓鼠移植瘤中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3 mRNA相对表达量分别下降了0.38、0.26、0.49、0.57倍，MHC Ⅰ、MHC ⅡmRNA相对表达量分别上升了1.93和1.75倍。

疫苗治疗组移植瘤组织COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3、MHC Ⅰ、MHC Ⅱ蛋白(见图2)相对表达量分别为1.179±0.015、0.248±0.007、0.764±0.006、0.814±0.009、1.689±0.010、0.389±0.001，对照组分别为2.008±0.011、0.682±0.014、1.220±0.005、1.718±0.004、1.133±0.007、0.267±0.001，两组各指标相比，P均<0.01。与对照组相比，疫苗治疗组仓鼠移植瘤中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3蛋白相对表达量分别下降了0.59、0.36、0.63、0.47倍，MHCⅠ、MHCⅡ蛋白相对表达量分别上升了1.49、1.45倍。

图2　 两组仓鼠移植瘤组织中COX-2、5-LOX、GAL-1、

3讨论

PANC-1细胞来源于人，与仓鼠具有很近的同源性，免疫排斥小。我们通过将PANC-1去甲基化和乙酰化表观遗传修饰后，再用IFN-γ刺激，即成功构建表观遗传修饰的肿瘤细胞疫苗。通过将仓鼠胰腺癌组织切碎后种植在新仓鼠腹股沟皮下，成功构建了仓鼠胰腺癌移植瘤模型。将疫苗注射在仓鼠移植瘤模型的附近，发现其能有效延缓仓鼠移植瘤的生长，移植瘤组织中COX-2、5-LOX、GAL-1、GAL-3的表达较对照组明显降低，而MHC Ⅰ、MHC Ⅱ的表达较对照组明显升高[15]。说明表观遗传修饰肿瘤细胞疫苗能有效激活仓鼠的抗肿瘤免疫效应，通过恢复MHC Ⅰ、MHC Ⅱ类分子的表达来，恢复肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导的特异性免疫反应, 激活免疫系统增强抗肿瘤免疫反应能力,抑制肿瘤的生长、转移,达到治疗肿瘤的目的。表观遗传修饰肿瘤细胞疫苗通过抑制COX-2、5-LOX的表达，抑制花生四烯酸的两条代谢途径，从而抑制肿瘤的生长及转移；通过抑制GAL-1、GAL-3的表达，能抑制肿瘤血管的生成及侵袭转移。有关表观遗传修饰肿瘤细胞疫苗的具体作用机制有待进一步研究。

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