线粒体乙醛脱氢酶2对β淀粉样蛋白所致神经元损伤的作用及机制

线粒体乙醛脱氢酶2对β淀粉样蛋白所致神经元损伤的作用及机制

杨英龚忠厚1李翠张倩王智斌韩亚军陈阳葛伟

(第四军医大学西京医院老年病科，陕西西安710032)

摘要〔〕目的探讨线粒体乙醛脱氢酶(ALDH)2对β淀粉样蛋白(Aβ)所致神经元损伤的作用及机制。方法应用HT-22小鼠海马神经元细胞系，MTT法检测明确Aβ25～35负载浓度制成Aβ神经元损伤模型；ALDH2激活剂Alda-1、ALDH2抑制剂Daidzin 干预后，Western印迹检测ALDH2蛋白表达水平；并采用ELISA检测4-HNE含量、以荧光素酶法检测细胞内的ATP含量。结果HT22细胞负载Aβ25～35(浓度50 μmol/L)时细胞生存率有显著降低；ALDH2激活剂Alda-1、ALDH2抑制剂Daidzin干预后，ALDH2蛋白表达水平并未发生变化，也并未导致细胞生存率改变；加入Alad-1后负载Aβ25～35的HT22细胞4-HNE含量显著减少，细胞内ATP含量明显提高，与Aβ组相比较有显著差异(P<0.05)。结论ALDH2激活后能有效减轻Aβ导致的神经元损伤，可能通过减少细胞内4-HNE含量、增加ATP含量实现其细胞保护的作用。

关键词〔〕阿尔茨海默病；线粒体乙醛脱氢酶2；β淀粉样蛋白

中图分类号〔〕R592〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(No.81271449，81471409)

通讯作者：葛伟(1972-)，女，副主任医师，副教授，医学博士，硕士生导师，主要从事老年病学医疗、教学、科研工作。

1兰州军区临潼疗养院第二疗养区

第一作者：杨英(1984-)，男，在读硕士，医师，主要从事阿尔茨海默病机制及治疗研究。

Effects and mechanism of mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 on neuronal damage caused by amyloid

YANG Ying, GONG Zhong-Hou, LI Cui,etal.

Department of Geriatrics, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi′an 710032, Shaanxi, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the role of mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2 (ALDH2) on neuronal damage induced by β-amyloid(Aβ).MethodsHT-22 mouse hippocampal neuronal cell line was used, MTT was used to determine Aβ concentration. Western bolt was used to detect ALDH2 protein level, ELISA was used to detect 4-HNE content, luciferase enzyme was used to detect intracellular ATP content.ResultsThe cell survival rate was significantly decreased when HT22 cells loaded with 50 μmol/L Aβ25～35. The expression level of ALDH2 protein and the cell survival rate of HT22 did not change when intervened by ALDH2 activator Alda-1 and the inhibitor Daidzin, further experimental results showed that Alad-1 could improve the increased 4-HNE content and the reduced ATP in HT22 when cells loaded Aβ25～35.ConclusionsALDH2 activation might elicit neuronal protective effect against Aβ25～35 through reducing 4-HNE levels and increasing ATP content of the intracellular.

【Key words】Alzheimer′s disease; Mitochondrial aldehyde dehydrogenase 2;β-amyloid

乙醛脱氢酶(ALDH2)因其能够直接、间接介导机体各组织器官、细胞代谢过程中产生的细胞毒性反应性醛类等物质，在细胞保护方面起着举足轻重的关键性作用〔1〕。ALDH2基因缺失增加患阿尔茨海默病(AD)的危险性，ALDH2敲除小鼠更易遭受氧化应激损伤、出现增龄相关性神经退行性病理改变和记忆力丧失〔2〕。然而ALDH2能否在细胞水平、在β淀粉样蛋白(Aβ)负载后所致AD细胞模型上实现其神经细胞保护效应及其机制目前尚不明确。本实验观察ALDH2对Aβ所致海马神经元HT22细胞系损伤的影响。

1材料和方法

1.1材料Aβ25～35购于Sigma(SCP0014)公司。ALDH2抑制剂Daidzin购自Enzo(CAS552-66-9)，ALDH2激活剂Alda-1购自Gemany Merck(CSA349438-38-6)。HT22细胞由第四军医大学西京医院神经外科惠赠。

1.2细胞培养小鼠海马神经元HT22细胞，以10%胎牛血清( Gibco 16000-044)和90%高糖DMEM( Gibco 11995-065)培养，细胞培养条件37℃孵箱5%CO2与95%空气。密度60%～80%时加入药物进行干预。Aβ25～35溶解于无菌水中，37℃老化7 d。设计浓度梯度0、20、50、100 μmol/L 。ALDH2抑制剂Daidzin溶解于DMSO，ALDH2激活剂Alda-1溶解于DMSO，与Aβ共同加入细胞培养体系中。

1.3MTT实验含10%胎牛血清的培养液配成单个细胞悬液，以每孔1 000～10 000个细胞接种到96孔板，每孔体积200 μl。同一般培养条件，培养3～5 d每孔加MTT溶液20 μl。继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150 μl DMSO，振荡10 min，使结晶物充分融解。选择490 nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡率取对数生长期细胞，以1×106传代至六孔板中，第一组：空白对照组；第二组：Aβ50 μmol/L；第三组：Alda-1 50 μmol/L；第四组：Daidzin 60 μmol/L；第五组：Aβ 50 μmol/L+Alda-1 50 μmol/L；第六组 Aβ 50 μmol/L+Daidzin 60 μmol/L处理24 h后，送第四军医大学免疫教研室流式细胞中心，进行流式凋亡率检测。

1.5ELISA检测4-HNE含量取对数生长期细胞，以2×105传代至24孔板，分为六组分组同上所述，每组设三个复孔处理24 h，用PBS(pH7.2～7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成分，制成样品进行ELISA检测。用纯化的小鼠4-HNE抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入4-HNE再与HRP标记的4-HNE抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的4-HNE呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算样品中小鼠4-HNE浓度。

1.6Western印迹取对数生长期细胞，传代至六孔板密度1×106，Alda-1组浓度设定分别0、10、20、50、100 μmol/L；Daidzin浓度设定分别为0、10、30、60、120 μmol/L药物处理24 h后提取蛋白，配10%SDS-PCAG凝胶。一抗anti ALDH1/2 1∶1 000(Santa)过夜，二抗：山羊Anti-兔IgG H&L (HRP) (ab6721)。使用ImageJ软件扫描灰度与GAPDH对比得出蛋白相对灰度值。

1.7荧光素酶法检测ATP含量取对数生长期细胞，以1×106传代至六孔板中，第一组：阴性对照组；第二组：Aβ 50 μmol/L；第三组：Alda-1 50 μmol/L；第四组：Daidzin 60 μmol/L；第五组：Aβ 50 μmol/L+Alda-1 50 μmol/L；第六组Aβ 50 μmol/L+Daidzin 60 μmol/L，处理24 h后，使用ATP检测试剂盒(Beyotime S0026)按照步骤操作。

1.8统计学方法采用SPSS19.0统计学分析软件对数据的组间比较进行t检验。

2结果

2.1Aβ25～35对HT22的细胞损伤作用与空白对照组相比(3.51±0.25)，负载Aβ25～35浓度为20 μmol/L处理后细胞生存率无显著变化(3.03±0.33,P>0.05)，Aβ25～35浓度50 μmol/L处理后，细胞生存率有显著性降低(2.11±0.71,P<0.05)，且随着Aβ25～35浓度增加至100 μmol/L细胞生存率(1.44±0.20)与50 μmol/L组无显著性差别(P>0.05)。

2.2ALDH2对Aβ所致HT22细胞生存率的影响与阴性对照组(3.57±0.41)相比，Aβ组OD值明显减低(2.17±0.93,P<0.05)；但单纯应用Alda-1(3.44±0.33)、Daidzin(3.37±0.28)后，与阴性对照组相比细胞生存率无显著性变化。与Aβ组相比，Aβ+Alda-1组细胞生存率明显提高(3.31±0.47,P=0.02)；加入ALDH2抑制剂Aβ+Daidzin组较单纯使用Aβ组细胞生存率无差异(1.36±0.35，P>0.05)。

2.3Alda-1、Daidzin对ALDH2蛋白表达含量及对HT22细胞生存率的影响不同浓度Alda-1或Daidzin处理HT22细胞24 h后，细胞内ALDH2蛋白的含量无明显变化；且对HT22细胞生存率亦没有明显影响(P>0.05)，见表1，图1。

组别(μmol/L)吸光度(OD)组别(μmol/L)吸光度(OD)阴性对照组3.99±0.40阴性对照组3.27±0.16Alda-1103.53±0.91Daidzin103.44±0.53Alda-1203.51±0.11Daidzin303.31±0.33Alda-1503.62±0.08Daidzin603.68±0.08Alda-11003.41±0.77Daidzin1202.52±0.42

图1　Alda-1、Daidzin对ALDH2蛋白表达含量的影响

2.4ALDH2激活剂及抑制剂对神经元保护作用机制与阴性对照组相比，Aβ组4-HNE含量明显增加(P<0.05)；但单纯应用Alda-1、Daidzin后，对4-HNE含量无显著影响；与Aβ处理组相比，加入ALDH2激活剂Alad-1后4-HNE含量明显降低(P<0.05)；使用ALDH2抑制剂Daidzin后4-HNE含量与Aβ组相比无明显变化(P>0.05)。另外，荧光素酶法ATP含量检测发现，与阴性对照组相比，Aβ组ATP含量显著降低(P<0.05)，ALDH2激活后能显著改善细胞内ATP含量，与Aβ组相比有统计学差异(P<0.05)。见表2。

组别(μmol/L)4-HNE含量(ng/L)ATP含量(μmol/L)阴性对照组1.7±0.210.25±0.030Aβ504.1±0.631)0.11±0.0231)Alda-1501.6±0.110.22±0.025Daidzin601.8±0.160.23±0.024Aβ50+Alda-1502.4±0.212)0.21±0.0312)Aβ50+Daidzin604.4±0.351)0.10±0.081)

与阴性对照组比较：1)P<0.05；与Aβ50组比较：2)P<0.05

3讨论

本文结果提示ALDH2激活剂Alda-1能有效保护HT22细胞免受Aβ25～35损伤，并可能通过减少细胞内4-HNE含量、增加ATP含量实现其细胞保护的作用。

以乙酰胆碱酯酶抑制剂和(或)NMDA受体拮抗剂为主的药物治疗及对症治疗作为目前临床治疗AD的最主要方法，其疗效十分有限〔3〕。ALDH2是一个核编码线粒体酶，定位于线粒体基质〔1〕，在细胞保护方面发挥着关键性作用，能显著减少酒精相关性疾病的发病率，减少缺血再灌注导致的细胞损伤〔4〕。ALDH2在中枢神经系统中广泛表达，但其在中枢神经系统中的功能以及中枢神经系统相关疾病中的作用目前仍不明确。国内外流行病学调查研究结果显示，ALDH2缺失型患者AD患病率明显增高〔5〕；动物实验结果显示，ALDH2基因敲除小鼠更易遭受氧化应激损伤，表现出增龄相关性神经退行性病理改变及记忆力丧失等一系列神经功能障碍；细胞水平实验显示，在原代培养海马神经元中过表达ALDH2可有效抑制有毒醛类导致神经元凋亡、氧化应激及线粒体损伤〔6〕。ALDH2过表达有显著的脑卒中后神经元保护作用〔7〕。在小鼠的脑卒中缺血再灌注模型中过表达ALDH2能有效减轻氧自由基对神经元造成的损伤，使缺血区再灌注区域的神经元死亡数目减少〔8〕。但是，缺血再灌注和大量的有毒醛类处理和病理状态下的AD神经元损伤模式还是不同，以往实验均未涉及AD的核心机制——Aβ引起的神经元损伤，也没有回答ALDH2能否改善AD认知功能障碍、实现神经细胞保护。

Aβ通过氧化应激、细胞凋亡及促发炎症级联反应等途径引起或促进AD发展〔9〕。脑内神经元胞内Aβ沉积是AD致病的核心机制之一，也是治疗AD的潜在靶点之一〔10〕。4-HNE是细胞氧化应激条件下脂质过氧化产生，能与线粒体DNA结合导致线粒体损伤及功能障碍的毒性醛类〔6〕。有报道ALDH2能发挥其还原酶的作用，脱氢形成对细胞无伤害的乙酸，恢复神经元线粒体功能〔11〕。ATP是细胞最直接能量来源，是衡量线粒体功能的核心指标，AD病理条件下神经元线粒体ATP产生大量减少，导致神经元凋亡，是AD的重要发病机制。

本研究使用ALDH2的特异性激活剂Alda-1〔12〕，结果证实ALDH2激活能在细胞水平减少AD核心致病机制Aβ所致的神经元损伤，从而减少神经元的凋亡，并且这一作用可能与ALDH2含量关系不大，而与ALDH2还原酶活性有关。进一步研究显示Alda-1可以减少4-HNE的产生，使线粒体功能得到修复，并使ATP产生明显增加，进一步提示ALDH2激活后产生的细胞保护作用可能与线粒体凋亡信号通路有关。

流行病学调查显示ALDH2基因突变者更容易罹患AD〔13〕。我国人群的流行病学调查中，有40%中国人群中编码ALDH2蛋白的基因存在缺陷，酶蛋白487位的谷氨酸(Glu)被赖氨酸(Lys)取代，得到没有活性的ALDH2蛋白〔14〕。本文提示，ALDH2活性可能与AD发生、发展密切相关，而我国老年人群中大量的AD患者是否与ALDH2蛋白失活相关还需深入研究。

4参考文献

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〔2013-12-17修回〕

(编辑曹梦园)