阿尔茨海默病小鼠模型海马组织AtP5a1基因甲基化改变

唐晓琴+唐红+邓飞+阮思蓓+李昕+陈波+杨朝鲜+熊小明+唐明希

[摘要]目的初步探讨中期阿尔茨海默病（AD）的presenilin-1/presenilin-2双基因条件性敲除小鼠（dKOmice）模型中海马组织Atp5al基因的甲基化改变情况。方法运用简化的表观亚硫酸盐测序技术（RRBS）检测3只12月龄雌性dKO mice和3只同系同龄雌性野生型小鼠海马组织基因组DNA异常甲基化情况，利用Bismark（v0.7.4）软件进行对照分析获取异常甲基化基因。结果二代测序结果显示12月龄中度神经退行性病变AD dKO mice海马中Atp5al基因呈低甲基化状态（P<0.05）。结论Atp5al基因在中期ADdKO mice的海马中呈低甲基化状态，提示低甲基化的Atp5al基因可能作为参与中期AD病程的潜在候选基因。

[关键词]Atp5al基因；阿尔茨海默病；DNA甲基化；dKO inlce

阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一种以进行性记忆障碍及认知功能减退为主要临床表现的中枢神经系统退行性疾病，典型病理改变是大脑皮层和海马细胞外主要由β-淀粉样蛋白（amyloid β-protein，A p）沉积形成的老年斑和tau蛋白过度磷酸化形成的神经原纤维缠结。其发病机制复杂，涉及遗传因素、环境因素、成千上万个基因表达的改变及多种信号途径的调节，如Aβ的沉积、tau蛋白的过度磷酸化、氧化应激、炎症、能量代谢及细胞凋亡周期异常等。Mastroeni D等以同卵双胞胎作为研究对象，发现正常的和患AD的双胞胎尽管遗传基因相同，但是他们的表观遗传修饰却不同，AD患者的双颞侧皮层神经元中DNA甲基化水平显著低于正常的同卵同胎，而且，其发病年龄、临床表现和病程都相差很大。可见，表观遗传机制在AD的发病过程中扮演着十分重要的角色。

随着高通量测序技术的开展，AD相关基因的甲基化分析已经取得一些进展。本研究采用简化的表观亚硫酸盐测序技术（reduced representationbisulphite sequencing，RRBS）初步构建起了中期AD dKO mice海马组织基因组DNA甲基化图谱，从中发现Atp5a1基因呈低甲基化状态，可为后续进一步验证并探讨AD的表观遗传学机制提供潜在候选靶基因。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

美国Ya-Ping Tang教授（Louisiana State University，USA）为本实验提供了亲代小鼠（基因型为fPSl/fPSl，PS2-/-，Cre+/-），其遗传背景为B6CBAFl，是利用Cre/loxP系统条件性敲除前脑presenilin-1（PS1）基因，所得杂合子与利用基因打靶技术将presenilin-2（PS2）基因进行全身性敲除所得杂合子杂交而来。子代dKO mice的饲养、繁殖与基因型鉴定等如我们已报道所述。实验分组：12月龄雌性dKOmice（体重=35.0±2.6g）和同龄雌性野生型小鼠（体重=37.0±1.8g）各3只用于RRBS测序检测。

1.1.2海马组织的准备（1）乙醚麻醉后快速断颈处死实验小鼠；（2）用组织剪剪开皮毛，暴露头骨；（3）更换剪刀拨开颅骨，暴露全脑；（4）用眼科剪剥离全脑组织，转移至放于碎冰上的无菌平皿中；（5）用手术刀沿矢状缝把左右半球分开，迅速分离海马组织，装入已标记好的冻存管中，用封口胶封口，置于液氮罐中约30min后，转入-80℃冰箱中保存。

1.2方法

1.2.1 DNA提取TIANamp DNA提取试剂盒（货号DP304）购自天根生化科技有限公司。提取海马组织基因组DNA主要步骤包括：（1）将组织处理成细胞悬液；（2）裂解：在变性条件下用蛋白酶K裂解样本；（3）吸附：DNA吸附于纯化柱中的硅胶膜上；（4）清洗：将硅胶膜上吸附的蛋白、脂质等杂质洗掉；（5）洗脱：利用洗脱液TE将高纯度的DNA从硅胶膜上洗脱。运用紫外分光光度计测量OD值（0D260/280和0D260/230）和0.8%琼脂糖凝胶电泳（100V，40min）进行DNA质量检测。

1.2.2RRBS测序将纯化后的DNA提交到杭州联川生物技术有限公司进行甲基化谱RRBS测序（Illumina HiSeq 2500）。RRBS测序原理：运用限制性内切酶MsPI处理基因组DNA，产生末端包含CpG二核苷酸的片段后，在末端修复并加A尾和接头，根据大小（40-220bp）选择CpG丰富DNA片段，经重亚硫酸盐处理及PCR扩增后使用Illumina基因组分析仪进行测序。测序完成后，采用NGSQCToolkit_v2.3软件进行测序数据的质量控制，将5%以上碱基质量数低于30的序列过滤掉，并在Bismark（v0.7.4）软件中将过滤后的高质量测序数据比对到小鼠参考基因组序列上，分别计算每个样本Atp5al基因发生甲基化的碳（C）数比上总C数而得到其相对甲基化水平，再提取6个样本的相对甲基化水平，采用edgeR软件进行差异分析，获得异常甲基化基因。发生甲基化的筛选标注为P<0.05。

2结果

2.1海马组织DNA质量鉴定结果

经紫外线分光光度计测定，用于RRBS检测的海马组织基因组DNA样品满足：0D260/280≥1.8，0D260/230≥1.5（表1）。将提取的DNA进行0.8%琼脂糖电泳检测（100V，40min），结果显示：DNA样品电泳条带完整清晰，符合RRBS检测及单基因甲基化检测要求（图1）。

2.2Atp5a1基因甲基化筛选结果

RRBS检测完成后，利用Bismark（v0.7.4）软件同小鼠参考基因组序列进行对比分析，筛选出异常甲基化基因Atp5a1呈低甲基化状态。如表2所示，Atp5a1基因位于第十八号染色体外显子起始位点为77778732，终止位点为77778899，通过Bismark（v0.7.4）软件中将过滤后的高质量测序数据比对到小鼠参考基因组序列上，利用实验组与对照组测序结果，采取edger软件进行相对甲基化率差异分析，获得异常甲基化基因Atp5a1（P<0.05）。

3讨论

随着人口老龄化的日益加重，对AD发病机制的研究也越来越紧迫。流行病学调查显示，2014年用于护理患AD和其他痴呆患者的费用超过2170亿美元，预计到2015年用于65岁及以上AD患者的卫生保健、长期护理和临终关怀等服务的总费用将达2260亿美元。目前，每67秒就会有一个人被诊断为AD患者，预计到2050年，这个时间将缩短为33秒，每年将导致近100万新发病例。显然，AD已经成为一个举世瞩目的社会和医学问题。dKO mice模型已被证实具有AD样神经退行性疾病的典型表型，如大脑皮质和海马萎缩、侧脑室和第三脑室扩大、严重神经元的损失、神经胶质过多症、tau蛋白的过度磷酸化、学习和记忆功能丧失等。该动物模型容易存活、饲养和繁殖，于2个月龄时开始出现轻度记忆障碍，6个月龄时大脑皮层明显变薄，皮层神经元丢失达18%左右；12月龄时表现出中期AD样表型。本实验运用RRBS测序检测12月龄dKO mice和野生型小鼠海马组织中基因组DNA异常甲基化分布情况，利用相关生物软件对照分析，发现了存在于第十八号染色体外显子的Atp5al（ATP synthase-a）基因呈低甲基化状态。

Atp5a1基因编码的是ATP合成酶的a-亚基，ATP合成酶广泛分布于线粒体内膜上，负责将呼吸链中的ADP合成为ATP，Atp5a1基因缺失将导致该酶失活，使细胞凋亡。研究表明，Atp5a1在多种肿瘤细胞中表达异常，如在结直肠癌的肿瘤细胞中表达减少，而在胶质母细胞瘤、食管癌的肿瘤细胞中高度表达。此外，Seth R等还发现高水平的Atp5al表达与某些单核苷酸多态性（SNPs）和TP53突变有关，能促进宫颈上皮内瘤变（CIN）的发生，从而发展为肿瘤，而Atp5a1低水平的表达可能促进基因的微卫星不稳定性（MSI）肿瘤的发生。目前尚未发现有关该基因在AD发生机制中的研究报道，本实验RRBS测序结果显示，Atp5a1基因在12月龄dKO mice的海马中呈低甲基化状态，初步提示中期AD dKO mice模型的病理过程中低甲基化的Atp5a1基因可能发挥着一定作用。但由于本实验目前仅限于二代测序结果，研究样本量又有限，要进一步确定Atp5a1基因是否真正参与到中期AD dKO mice的病程，还需进一步采用甲基化特异性PCR、单基因甲基化测序、RT-PCR、免疫组化及免疫印迹等方法进一步验证并分析该基因甲基化状态、转录水平及蛋白水平等改变等情况，并将进一步扩大样本量，且结合早期及晚期dKO mice相应基因甲基化改变情况进行对比分析，为全面了解Vps33b基因的甲基化状态在中期AD中的生物学功能提供候选基因。

综上所述，RRBS测序结果初步显示Atp5a1基因在中度神经退行性病变AD dKO mice的病理进程中呈低甲基化状态，为进一步证实、筛选及研究AD发生的表观遗传机制、病理进程，以及AD基因靶向预防、治疗、预后判断等提供重要的候选线索。