琐琐葡萄多糖对阿尔茨海默病模型大鼠行为学和形态学的影响

李悦　马丽娟　袁芳

[摘要] 目的 探讨琐琐葡萄多糖（VTP）对Aβ25-35诱导的阿尔茨海默病（AD）模型大鼠学习记忆和海马神经元的影响。 方法 SPF级AD大鼠90只，随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组（多奈哌齐组，0.5 mg/kg）、VTP低、中、高剂量组（300、150、50 mg/kg）。采用双侧海马CA1区注射Aβ25-35建立AD模型，随后给予等体积的药物和蒸馏水进行分组灌胃，持续15 d。利用Morris水迷宫观察大鼠行为学；在光镜和电镜下观察大鼠海马CA1区神经元形态变化；并用TUNEL染色检测大鼠海马神经元细胞凋亡水平。 结果 与AD模型组比较，VTP低、中、高剂量组和多奈哌齐组能明显改善大鼠学习记忆能力（P < 0.05），明显改善海马神经元细胞形态，增加正常海马神经元数量（P < 0.05），降低海马神经元异常凋亡率（P < 0.05）。 结论 琐琐葡萄VTP通过减少Aβ诱导的海马CA1区神经元细胞的损伤及凋亡，发挥改善AD学习记忆能力和保护海马神经元的作用。

[关键词] 琐琐葡萄多糖；阿尔茨海默病；水迷宫；β-淀粉样蛋白；TUNEL染色

[中图分类号] R285 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）10（b）-0008-04

[Abstract] Objective To explore the effect of the polysaccharides from vitis vinifera L. （VTP） on hippocampal neurons and the ability of learning and memory in Alzheimers disease （AD） model rat. Methods Ninety male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group， model group， positive control group （Donepezil group， 0.5 mg/kg）， VTP low-dose， middles-dose and high-dose （300， 150， 50 mg/kg） group. Aβ 25-35 was injected into the bilateral hippocampal CA1 to induce AD models. The Morris water maze was used to investigate the ability of learning and memory. The Neurons morphological changes of hippocampal CA1 neurons was observed by light microscope and electron microscope. TUNEL staining was used to detect the apoptosis of hippocampal neurons. Results Compared with those of model group， the learning and memory abilities of VTP and Donepezil groups were significantly improved （P < 0.05）， the number of nerve norml cells was significantly increased and apoptosis cells was significantly decreased （P < 0.05）. Rats in the control group had no obvious morphological changes， and morphology of rat in the VTP and Donepezil groups was basical normal， however， the obvious deposition of cellular morphology was displayed in model group. Conclusion VTP can improve the ability of learning and memory， and protect the hippocampal neurons of AD model rat， through alleviating hippocampal CA1 neurons damage induce by amyloid beta .

[Key words] Polysaccharides from vitis vinifera L.； Alzheimers disease； Water maze； β-amyloid peptide； TUNEL staining

阿尔茨海默病（Alzheimers Disease，AD）是一种神经退行性疾病，其特点是进行性的记忆障碍。β淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）经过连续酶促作用产生的β-淀粉样蛋白（Aβ）在神经元细胞外聚集成的老年斑是AD关键的病理特征[1]。近年来，通过天然植物寻找改善AD症状和发展的研究越来越多，如姜黄素[2-3]、绿茶多酚、银杏叶提取物[4]、人参皂苷[5]均从减少Aβ聚集和细胞凋亡等方面取得了很好的治疗效果。琐琐葡萄是新疆传统维吾尔药物之一，已被提取出多种活性物质在抗氧化、抗衰老、抗病毒等方面有独特功效[6-8]。本研究通过Aβ25-35建立AD模型大鼠，从行为学、形态学、海马细胞凋亡等方面探讨琐琐葡萄多糖（The polysaccharides from vitis vinifera L.，VTP）活性成分对AD学习记忆能力的改善作用和对脑组织海马神经元的保护作用。

1 对象与方法

1.1 实验动物

SD大鼠90只（清洁级），雄性，体重（250±20）g，鼠龄7～8周，由新疆医科大学动物中心提供（质量合格证号：NO.650007000）。

1.2 试剂与仪器

VTP按照专利方法提取分离（专利号200710 201354）。Aβ25-35（Sigma公司，生理盐水溶解后置于37℃孵化7 d）；盐酸多奈哌齐片（卫材药业有限公司，批号：H20050978）；TUNEL试剂盒，（瑞士罗氏公司，批号：11684817910）。脑立体定位仪（德国TSE Systems，型号：540060）；Morris水迷宫视频跟踪分析系统（成都泰盟科技有限公司）；三目显微镜（德国Leica公司，型号：DM3000B）；透射电子显微镜（日本JEOL公司，型号：JEM-1230）。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组及干预 实验动物随机分为6组：正常对照组、模型组、阳性对照组（多奈哌齐组）、VTP高、中、低剂量组，每组15只，在SPF实验室正常饲养1周后建立模型。模型建立方法：3.0%戊巴比妥钠麻醉大鼠，定位海马CA1区钻孔，用微量进样器将10 μL（每侧5 μL，含10 μg）Aβ25-35溶液分别注入左右海马（正常对照组给予生理盐水），留针5 min。随后分组灌胃给药，每日1次（1.0 mL/100 g），连续15 d，为避免主观影响采取双盲方法。正常对照组和模型组大鼠给予蒸馏水灌胃；阳性对照组给予多奈哌齐溶液（多奈哌齐粉末溶于蒸馏水后充分震荡摇匀，0.5 mg/kg）进行灌胃；VTP高、中、低剂量组分别灌胃300、150、50 mg/kg。

1.3.2 水迷宫实验 动物于给药第13天开始进行双盲水迷宫训练。定位航行实验（前6 d）：平台置于第3象限，大鼠从对象限入池，每次训练90 s，利用大鼠水迷宫系统自动记录所需的各项指标。第6天训练成绩作为测试结果。空间探索试验（第7天）：撤去平台，每只大鼠在原入池位置释放，记录其90 s内在原平台所在象限的游泳时间占总时间的百分比及其穿越有效区域位置（1.5倍原平台所在区域位置）的次数。

1.3.3 石蜡切片制备及HE染色 每组随机抽取12只大鼠麻醉后进行灌注取脑，脑组织固定于4%多聚甲醛。制备石蜡切片（每个脑组织切片6张），常规HE染色（每个脑组织3张），光学显微镜下观察海马神经元形态结构变化，每组选取6张计数海马CA1区正常神经元数目。

1.3.4 电镜标本制备及指标观察 每组随机抽取3只实验大鼠断头取脑，分离出海马组织，放置于电镜固定液中固定。进行脱水、包埋、切片常规处理后用电子显微镜观察海马神经元超微结构变化并采集图像。

1.3.5 TUNEL细胞凋亡检测 按照罗氏TUNEL试剂盒的检测方法对大鼠脑组织石蜡切片标本（每个脑组织3张）进行细胞凋亡的检测，并利用光学显微镜对海马组织细胞形态进行观察并采集图像。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VTP对AD大鼠水迷宫实验的影响

在后3 d的训练中，可明显观察到模型组大鼠相对于其余各组需要花更多的时间找到平台（图1A）。第6天测试成绩（图1B），与对照组比较，模型组大鼠潜伏期明显增加（P < 0.05）；与模型组比较，多奈哌齐组和VTP低、中、高剂量组潜伏期显著缩短（P < 0.05）。第7天空间探索实验中原平台所在象限停留时间百分比和穿越有效区域位置次数，模型组较正常对照组明显减少（P < 0.05）；不同剂量VTP组和多奈哌齐组均较模型组有所增加（P < 0.05）。见表1。

2.2 VTP对大鼠海马CA1区神经元形态变化的影响

光镜下可见（图2，A～F），正常对照组海马神经细胞排列规整，胞核清晰。模型组可见大量排列不规则神经元，层数减少，胞体缩小，多见多边形或圆齿状染色质浓缩的胞核（箭头所示），呈凋亡趋势。多奈哌齐组和VTP高、中、低剂量组的海马神经元排列相较模型组规整，排列较紧密，核固缩浓染明显减轻，可见个别病变形态海马神经元（箭头所示）。正常对照组和模型组之间正常神经元细胞数目的差异有统计学意义（P < 0.05）；多奈哌齐组和VTP高、中、低剂量组的正常海马神经元数目较模型组多（P < 0.05）。

2.3 VTP对海马神经元超微结构的影响

透射电镜下（如图3，A～F），正常对照组神经细胞核膜光滑，染色质细小均匀，胞浆内细胞器结构完整未见异常。模型组神经元出现凋亡，周围出现水肿，核膜破裂、皱褶，核染色质凝聚、边聚。多奈哌齐组和VTP各剂量组神经元形态较好，核膜较完整，只有少量皱缩，细胞核轻度固缩，核内染色质分布均匀，胞质内细胞器尚属正常。

2.4 VTP对各组大鼠海马神经元凋亡的影响

光镜下TUNEL染色结果（图4，A～F），深棕褐色细胞为凋亡细胞，模型组较对照组凋亡细胞表达明显增多，多奈哌齐组和VTP低、中、高剂量组呈现零星散在分布的棕褐色细胞。模型组HE染色正常细胞个数少于正常对照组、多奈哌齐组及VTP各剂量组（P < 0.05）；模型组凋亡率较正常对照组增高（P < 0.05），多奈哌齐组及VTP各剂量组的细胞凋亡率较模型组显著减少（P < 0.05）。

3 讨论

聚集的Aβ对海马神经细胞体内外的神经毒性作用是AD发病的一个中心事件[9-10]，被认为是AD各种病理改变的共同通路，是AD形成和发展的关键因素[11-14]。本研究从此方面入手，利用Aβ1-42的核心毒性片段Aβ25-35[15]，建立出拟AD的动物模型。有相似的模型实验显示[16]，大鼠海马CA1区神经元受损最明显，因此本实验的造模和结果观察重点放在大鼠海马CA1区。近年来的研究表明，人参、枸杞、黄芪、灵芝等多糖对神经细胞有保护作用[17-19]。为了发挥维药琐琐葡萄多糖在医药保健方面的功能，本研究针对多糖的神经保护作用进行动物实验。

本研究结果显示，模型组AD大鼠学习、记忆能力减退，海马神经元损伤严重，细胞调亡率显著增加，显示造模成功。与模型组比较，大鼠经过15 d的VTP或多奈哌齐治疗后进行水迷宫实验，在定位航行和空间探索实验中均发现空间学习记忆能力有明显的改善。脑组织海马神经元对空间记忆能力具有很重要的作用[20]，海马神经元的损伤可能是导致大鼠水迷宫实验逃逸潜伏期延长的原因。最新的研究表明，琐琐葡萄多糖对Aβ25-35诱导的PC12细胞凋亡具有抑制作用[21]，本实验在VTP和多奈哌齐治疗后，核固缩和凋亡神经细胞较模型组也明显减少，说明VTP能降低Aβ对AD大鼠的毒性作用。

综上所述，海马CA1区神经元形态学改变及凋亡可能是导致AD大鼠学习记忆障碍的重要原因之一。VTP对Aβ诱导的海马CA1区神经元细胞的损伤及凋亡具有明显的改善作用，是可以作为AD治疗的新药的探讨方向。对于VTP活性成分改善神经元损伤的途径及机制，需在后续的实验中进行深入的探讨。

[参考文献]

[1] Mandel SA，Amit T，Kalfon L，et al. Cell signaling pathways and iron chelation in the neurorestorative activity of green tea polyphenols：special reference to epigallocatechin gallate （EGCG） [J]. J Alzheimers Dis，2008，15（2）：211-222.

[2] Nisbet RM，Nigro J，Breheney K，et al. Central amyloid-β-specific single chain variable fragment ameliorates Aβ aggregation and neurotoxicity [J]. Protein Eng Des Sel，2013， 26（10）：571-580.

[3] Seo JS，Kim TK，Leem YH，et al. SK-PC-B70M confers anti-oxidant activity and reduces Abeta levels in the brain of Tg2576 mice [J]. Brain Res，2009，1261：100-108.

[4] Luo Y，Smith JV，Paramasivam V，et al. Inhibition of amyloid-beta aggregation and caspase-3 activation by the Ginkgo biloba extract EGb761 [J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99（19）：12197-12202.

[5] Chen F，Eckman EA，Eckman CB. Reductions in levels of the Alzheimers amyloid beta peptide after oral administration of ginsenosides [J]. FASEB J，2006，20（8）：1269-1271.

[6] 刘涛，马龙，赵军，等.琐琐葡萄多糖的提取及抗氧化能力研究[J].新疆医科大学学报，2007，30（11）：1230-1232.

[7] 俞丹，赵军，刘涛，等.琐琐葡萄多糖对小鼠免疫功能的影响[J].食品科学，2010，31（9）：229-233.

[8] 刘涛，赵军，李海波，等.琐琐葡萄多糖体外抗乙型肝炎病毒作用的实验研究[J].中国药理学通报，2011，27（1）：147-148.

[9] Pike CJ，Walencewicz AJ，Glabe CG，et al. In vitro aging of beta-amyloid protein causes peptide aggregation and neurotoxicity [J]. Brain Res，1991，563（1-2）：311-314.

[10] Butterfield DA，Castegna A，Lauderback CM，et al. Evidence that amyloid beta-peptide-induced lipid peroxidation and its sequelae in Alzheimers disease brain contribute to neuronal death [J]. Neurobiol Aging，2002，23（5）：655-664.

[11] Fang D，Wang Y，Zhang Z，et al. Increased neuronal PreP activity reduces Aβ accumulation，attenuates neuroinflammation and improves mitochondrial and synaptic function in Alzheimer diseases mouse model [J]. Hum Mol Genet，2015，24（18）：5198-5210.

[12] Christensen DZ，Huettenrauch M，Mitkovski M，et al. Axonal degeneration in an Alzheimer mouse model is PS1 gene dose dependent and linked to intraneuronal Aβ accumulation [J]. Front Aging Neurosci，2014，6：139.

[13] Izco M，Martínez P，Corrales A，et al. Changes in the brain and plasma Aβ peptide levels with age and its relationship with cognitive impairment in the APPswe/PS1dE9 mouse model of Alzheimers disease [J]. Neuroscience，2014，263：269-279.

[14] Zhu L，Zhong M，Zhao J，et al. Reduction of synaptojanin 1 accelerates Aβ clearance and attenuates cognitive deterioration in an Alzheimer mouse model [J]. J Biol Chem，2013，288（44）：32050-32063.

[15] Whitehead SN，Hachinski VC，Cechetto DF. Interaction between a rat model of cerebral ischemia and beta-amyloid toxicity：inflammatory responses [J]. Stroke，2005，36（1）：107-112.

[16] DAgostino G，Russo R，Avagliano C，et al. Palmitoylethanolamide protects against the amyloid-β25-35-induced learning and memory impairment in mice，an experimental model of Alzheimer disease [J]. Neuropsychopharmacology，2012，37（7）：1784-1792.

[17] 李源，刘颖，袁海峰，等.人参皂苷Rg1对阿尔茨海默病模型大鼠脑片磷酸化Tau蛋白及胆碱乙酰基转移酶表达的影响[J].中国老年学杂志，2015，35（6）：1640-1641.

[18] 李宜培，王雪银，陈洁，等.灵芝多糖肽对阿尔茨海默病大鼠β淀粉样蛋白含量和tau蛋白过度磷酸化的影响[J].中华实用诊断与治疗杂志，2015，29（9）：862-865.

[19] 费洪新，高音，孙丽慧，等.黄芪多糖对阿尔茨海默病小鼠海马组织的影响[J].中国老年学杂志，2015，35（16）：4426-4429.

[20] Matsuzaki M，Honkura N，Ellis-Davies GC，et al. Structural basis of long-term potentiation in single dendritic spines [J]. Nature，2004，429（6993）：761-766.

[21] 袁芳，徐琦，盛磊，等.琐琐葡萄多糖对β淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的影响[J].中国老年学杂志，2015，35（19）：5372-5373.

（收稿日期：2016-07-10 本文编辑：任 念）