重组槲寄生凝集素抗肝癌作用

重组槲寄生凝集素抗肝癌作用

杨学良任强王广义1

(北华大学附属医院普外科，吉林吉林132011)

摘要〔〕目的探讨重组槲寄生凝集素-Ⅰ(rVAA-Ⅰ)对体外培养的人肝癌细胞株SMMC-7721的抑制作用及相关机制。方法通过四氮唑比色法(MTT)、流式细胞术、透射电镜及Caspase检测rVAA-Ⅰ对SMMC-7721细胞增殖抑制效应，通过基因芯片分析找到差异基因。结果rVAA-Ⅰ诱导SMMC-7721细胞凋亡，在rVAA-Ⅰ浓度8 ng/ml时，有30%的细胞发生凋亡；在16 ng/ml时，细胞凋亡增加到44%；在32 ng/ml时，细胞凋亡达到51%。表明，rVAA-Ⅰ可以诱导SMMC7721细胞凋亡，并且具有剂量依赖性。在16 ng/ml时，随着给药时间的延长，对细胞抑制作用增强，48 h细胞的存活率最低，达30%，存在时间-效应关系，同时证实rVAA-Ⅰ诱导的细胞凋亡与Caspase有关。结论rVAA-Ⅰ具有直接抗SMMC-7721细胞作用,在肿瘤免疫学的基础和临床应用研究中具有前景。

关键词〔〕SMMC-7721；重组槲寄生凝集素-Ⅰ；毕赤酵母

中图分类号〔〕R57〔文献标识码〕A〔

通讯作者：任强(1960-)，男，主任医师，主要从事消化道肿瘤研究。

1吉林大学第一医院肝胆胰外科

第一作者：杨学良(1974-)，男，副主任医师，博士，主要从事肝胆及胃肠道肿瘤研究。

槲寄生(Viscum album)是一类依赖落叶树木生长的半寄生植物的总称。早在1920年，奥地利学者就发现槲寄生的提取物是一种天然的抗癌药物，近来的研究发现其中的植物凝集素(Agglutinin)在抗癌活性中发挥最为重要的作用〔1〕。从槲寄生提取物中可分离获得种凝集素亚单位，均属核糖体灭活蛋白家族，分别为槲寄生凝集素(VAA)-Ⅰ、-Ⅱ、-Ⅲ。而VAA-Ⅰ的生物活性最强〔2〕。本实验拟证实rVAA-Ⅰ体外抗肝癌作用。

1材料与方法

1.1细胞株、主要试剂人肝癌细胞株SMMC7721购自吉林省肿瘤医院。培养基：IMDM干粉(购于美国GIBCO公司)，溶解于800 ml蒸馏水中，加入100 μg/ml链霉素，100 IU/ml青霉素，NaHCO33.7 g， pH值调至7.2～7.4，过滤除菌，4℃保存。胎牛血清购于美国GIBCO公司，rVAA-Ⅰ为自制，流式细胞仪购于美国BD公司，细胞培养箱购于美国Forma Scientific 公司，凝胶分析系统购于瑞典Pharmacia公司。Human Genome Array、 SmartArray购于北京博奥生物。

1.2SMMC7721细胞的培养将SMMC7721细胞冻存管放入37℃的水浴锅中溶解，复苏的SMMC7721细胞加入含10%胎牛血清的培养液， 37℃培养，当细胞贴壁大于底的75%以上时进行细胞传代，无菌冻存管中分装，液氮中长期保存供使用〔3〕。

1.3MTT比色法测定rVAA-Ⅰ对SMMC7721细胞存活率的影响取对数生长期的SMMC7721细胞，胰酶消化成单细胞悬液， 37℃、5%CO2中培养。待细胞完全贴壁后换液，分别用终浓度为1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0 ng/mL的rVAA-Ⅰ处理细胞，对照组加入等体积培养液，每组设4个平行孔，37℃、5%CO2中分别培养12、24、48 h。取出96孔板，每孔加入MTT溶液5 mg/ml 10 μl，37℃、5%CO2中继续培养4 h，每孔加入DMSO 150 μl，于振荡器上振摇，待蓝紫色结晶物完全溶解后，在酶标仪上检测A570处的吸光度值。分别计算不同浓度的rVAA-Ⅰ对SMMC7721细胞存活率的影响。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡采用FITC-AnnexinV/PI双荧光标记，流式细胞术检测细胞凋亡的变化情况。取对数生长期的SMMC7721细胞，用0.25%胰酶消化成单细胞悬液，计数调整细胞密度为1.5×105个/ml，每孔 3.0×105接种于6孔板中。培养至细胞完全贴壁后弃掉培养液，换成含不同浓度rVAA-Ⅰ的培养液，每个浓度4个平行样。37℃、5%CO2培养箱内培养 24 h，收集细胞并用冷的PBS溶液冲洗两次，调细胞浓度为1×105/ml。取1 ml，离心(1 000 r/min，5 min)弃上清，加入195 μl 结合缓冲液和5 μl FITC标记的AnnexinV抗体，常温避光放置20 min。预冷的PBS洗2次，再加依次入190 μl 结合缓冲液和PI 10 μl，4℃、15 min避光保存。流式细胞仪收集1×104个细胞，用Cellquest软件分析凋亡结果，以凋亡细胞的百分率表示。

1.5透射电镜观察细胞凋亡情况取对数生长期的SMMC7721细胞，培养至细胞完全贴壁后弃掉培养液，加入含终浓度为16 ng/ml的培养液进行干预，对照组加等体积的培养液。换成含不同浓度rVAA-Ⅰ(0.2、1.0、5.0 μg/ml)的培养液，每个浓度4个平行样。培养 24 h后移入50 ml离心管中进行离心，弃去培养液固定2 h。按透射电镜实验要求制作样品，经枸橼酸铅染色后在10 000倍视野下观察细胞凋亡情况，随机照相记录观察结果。

1.6Caspase抑制剂z-VAD-fmk对rVAA-Ⅰ抑制细胞增殖的影响处于对数生长期的SMMC7721细胞以1.5×105个/ml细胞密度接种于96孔板中，培养过夜；然后加入50 mmol/L的Caspase家族抑制剂z-VAD-fmk，继续培养30 min；而后分别加入浓度为8、16、32 ng/ml rVAA-Ⅰ处理24 h后，MTT法计算抑制率〔4〕。

1.7芯片杂交采用22K Human Genome Array，共有21 522条Oligo DNA。Oligo库用SmartArray点制在一张经过化学修饰、大小为7.5 cm×2.5 cm的载玻片上。取对数生长期的细胞，提取总RNA，探针标记、杂交、洗片，用LuxScan10KA双通道激光扫描仪进行基因芯片扫描， LuxScan 3.0图像分析软件对芯片图像进行分析。差异基因筛选，运用One timecourse分析方法，选择FalseDiscovery Rate<0.1时差异显著的基因，并对这些差异显著基因的表达模式进行聚类分析。

1.8实时定量PCR根据芯片分析的结果，查找需要验证的目的序列，设计引物，并交由北京英茂盛业公司合成，以反转录产物为模板，按照SYBR®Green Realtime PCR Master Mix(QPK-201)说明书，加入各种反应物，常规反应条件，在美国Bio-Rad伯乐Chromo4多色实时PCR扩增仪上进行扩增反应。

1.9统计学方法采用SPSS12.0软件行单因素方差分析。

2结果

2.1rVAA-Ⅰ对SMMC7721细胞存活率的影响8 ng/ml的剂量下，可以显示出对SMMC7721细胞的增殖具有较弱的抑制效果，当浓度增加到16 ng/ml时，抑制效果变得更为明显。rVAA-Ⅰ可剂量依赖性地对SMMC7721细胞的增殖起到抑制作用，24 h的IC50为16 ng/ml。随着给药时间的延长，对细胞抑制作用增强，细胞的存活率明显下降，存在时间-效应关系。见表1。

对照组VAA-Ⅰ浓度(ng/ml)124816326412812h100±1.4095.68±3.5692.34±5.5289.03±7.861)67.12±8.021)48.45±8.011)29.33±9.521)20.05±9.031)18.22±10.331)24h100±1.5090.12±6.8189.08±7.561)87.68±7.851)56.11±8.221)38.12±8.411)18.54±9.611)16.58±9.521)13.02±12.361)48h100±1.5089.12±7.911)88.68±7.911)85.65±7.961)54.68±8.351)30.78±8.561)19.25±9.881)14.37±9.931)11.38±12.931)

与对照组比较:1)P<0.05

2.2rVAA-Ⅰ可以诱导SMMC7721细胞凋亡不同浓度的rVAA-Ⅰ处理SMMC7721细胞24 h，分别用Annexin V-FITC与PI分别检测细胞早期凋亡与末期细胞凋亡情况，在各个剂量组中凋亡细胞的数量同对照组相比均有所增加。结果表明，rVAA-I可以诱导SMMC7721细胞凋亡，并且具有剂量依赖性。

2.3rVAA-Ⅰ诱导的细胞凋亡与Caspase有关50 mmol/L的Caspase抑制剂z-VAD-fmk可以显著抑制rVAA-Ⅰ诱导的SMMC7721细胞凋亡。8、16、32 ng/ml VAA-Ⅰ时caspase水平分别为(54.68±8.35)%、(30.78±8.56)%、(19.25±9.88)%，与对照组差异显著(P<0.05)。

2.4透射电镜观察rVAA-Ⅰ对肝癌细胞的影响透射电镜下可见经rVAA-Ⅰ(16 ng/ml)处理的SMMC7721细胞出现核固缩、核膜破裂、消失，染色质凝集、细胞质中空泡增多，核间隙明显变宽、核膜消失，细胞器结构不清，核断裂等现象(白色箭头)。而对照组细胞体积较大，核质比例较高，常染色质丰富，异染色质较少，沿细胞核膜分布，核仁居中或边移，细胞质内线粒体丰富。见图1。

图1　透射电镜观测rVAA-Ⅰ(16 ng/ml) 处理的SMMC7721细胞的形态学改变(×8 000)

2.5基因芯片分析结果对照组和给药组之间的差异基因使用了Limma算法进行显著性水平的计算，筛选标准为：LogFC>1或者LogFC<-1，错误发现率(FDR)<0.01,B值>1.5的基因为差异基因，整体芯片找到3 200个差异基因用于后续实验分析，绿色为下调基因，红色为上调基因，见图2。

图2　差异基因分析结果

2.6定量RT-PCR结果MAPK信号通路中的3个差异表达基因MAPK14，IMPA1和SMNDC1与基因芯片的分析结果完全一致，证实基因芯片的分析结果是可信的。

3讨论

手术切除为肝癌获得根治的最佳手段，但肝癌发现多属于晚期，手术难以切除，且术后容易复发〔5〕。研究报道，根治性手术切除后，仍有60%～70%的患者在5年内出现转移和复发。而目前市场上的化疗药物也不尽如人意，存在着骨髓抑制、消化道反应、呕吐等严重的毒副作用。

槲寄生在欧美被称为“生命中的金枝”〔2〕。专家预测槲寄生有望成为继紫杉醇之后又一种天然抗癌药物〔2,6〕。VAA-Ⅰ的获得主要是采用传统的分离、提取方法从槲寄生中获得，由于其含量低，提取分离方法复杂，限制了其应用〔7〕。毕赤酵母是低等真核生物，于20世纪80年代初开发获得，非常有利于真核基因的表达，具有对外源表达蛋白进行正确加工，修饰及合理的空间折叠等功能，能有效克服大肠杆菌等原核表达系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足；同时，酵母细胞具有生长快，操作简单，易于培养等原核生物的优点。因此，毕赤酵母表达系统受到越来越多的重视，已广泛用于重组蛋白质的生产，被美国食品和药品管理局(FDA)证实为是安全、可靠的，其表达的药用蛋白不需进行大量的宿主安全性实验。

SMMC7721细胞的全基因组转录谱表明，大量的基因表达发生在rVAA-Ⅰ杀伤细胞的过程中。一些与核相关的GO分类，包括MAPK信号通路(RAP1B，MAPK14，FLNA)的细胞凋亡(SMNDC1)，蛋白酶(PSMA2，PSMA4)，核黄素代谢(RFK，MTMR6)，色氨酸代谢( FANCL，BRAP)，TGF-β的信号通路(AMH)，磷脂酰肌醇信号的系统(IMPA1)和氧化磷酸化(PPA2)〔8〕。本研究中，当细胞暴露于rVAA-Ⅰ FLNA，MAPK14，RAP1B的基因表达改变。FLNA已经牵连的各种胞外刺激诱导的MAPK信号，并且它可以与MAPK激酶MEK1和MKK4〔9〕进行交互。它也可以是核糖体蛋白S6激酶ERK的目标〔4〕。此外，还涉及了几个基本的细胞功能，如黏附，迁移，极性，分化和增长。综上，体外证实了VAA-Ⅰ抗肝癌作用，为体内研究奠定了基础。

4参考文献

1龚祝南. 槲寄生类植物抗肿瘤活性蛋白成分的结构、功能及其作用机制的研究进展 〔J〕. 中国生化药物杂志,2001;22(5):259-62.

2Bussing A,Suzart K,Bergmann J,etal. Induction of apoptosis in human lymphocytes treated with Viscum album L. is mediated by themistletoe lectins〔J〕. Cancer Lett,1996;99(1):59-72.

3徒震强,吴军正. 细胞培养 〔M〕. 北京：世界图书出版公司,2004：138.

4Koyama Y,Tohyama M. Involvement of caspase-4 in endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis and β-induced 〔J〕. J Cell Biol,2004;165:347-56.

5Tang ZY,Yu YQ,Zhou XD,etal. Progress and prospects in hepatocellular carcinoma surgery 〔J〕. Ann Chir,1998;52(6):558-63.

6Bar-Sela G,Gershony A,Haim N. Mistletoe(Viscum album)preparations:an optional drug for cancer patients 〔J〕. Harefuah,2006;145:42-6.

7周彬,杨文革,缪建,等. 槲寄生凝集素粗品提取工艺研究 〔J〕. 中成药,2007;29(5):162-4.

8Scott MG,Storez H. Cooperative regulation of extracellular signal-regulated kinase activation and cell shape change by filamin A and β-arrestins 〔J〕. Mol Cell Biol,2006;26:3432-45.

9Momoi T. Caspases involved in ER stress-mediated cell death 〔J〕. J Chem Neuroanat,2004;28:101-5.

〔2013-11-25修回〕

(编辑苑云杰)