匹伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注后氧化应激作用的影响

尤　杨，冯　倩，夏　岳*，戚国庆，张　燕，张庆文

(1.河北医科大学第一医院心内三科,河北 石家庄 050031;

2.河北省张家口市第一医院心内三科,河北 张家口 075000)

·论著·

匹伐他汀对大鼠心肌缺血再灌注后氧化应激作用的影响

尤杨1，冯倩2，夏岳1*，戚国庆1，张燕1，张庆文1

(1.河北医科大学第一医院心内三科,河北 石家庄 050031;

2.河北省张家口市第一医院心内三科,河北 张家口 075000)

[关键词]心肌再灌注损伤；匹伐他汀；氧化性应激

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.04.001

对于急性心肌梗死患者，尽早开通梗死动脉，迅速而持久地恢复梗死动脉的前向血流，对于挽救濒临死亡的心肌、防止扩大梗死面积、保护心肌的泵血功能、提高早期存活率和降低病死率有着极其重要的意义。而缺血心肌在一定时间内恢复血液再灌注后，原心功能不仅没有恢复，反而出现了使功能代谢障碍及结构破坏进一步加重的现象，即心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)[1]。其机制尚未明确，目前已成为困扰临床诊疗效果的重要问题以及研究热点。他汀类药物，即3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A抑制剂，是目前临床上应用最广泛的调脂药物，且在防治MIRI的研究中，其显示出多种机制的心脏保护作用。本研究通过制作匹伐他汀预处理的大鼠心肌缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)模型，观察匹伐他汀预处理是否能减轻大鼠MIRI，缩小心肌梗死面积，并进一步探讨其机制，旨在为他汀类药物在干预缺血再灌注心肌的临床应用上提供更多的理论依据。报告如下。

1材料与方法

1.1实验动物成年雄性清洁级SD大鼠42只，体质量(250±20) g，由河北省实验动物中心提供，许可证号为医动字第04037，动物等级为无特定病原体动物。将42只SD大鼠随机分为3组各14只，术前3个组均于每日上午8:30~9:30，25 ℃室温下以生理盐水等量等温灌胃，1次/d。假手术组(Sham组)生理盐水2 mL/d灌胃4周，术中冠状动脉的左前降支(left anterior descending，LAD)下只穿线，不结扎，也不再灌注。IR组生理盐水2 mL/d灌胃4周，术中结扎LAD 30 min，再松解120 min，建立IR模型。匹伐他汀组(Statin组)术前匹伐他汀0.42 mg·kg-1·d-1用生理盐水溶解成2 mL，1次/d，灌胃4周，建模过程同IR组。

1.2主要试剂超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程公司)；BAC蛋白定量试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)检测试剂(河北医科大学第一医院检验科提供)；伊文思蓝(美国Sigma公司)；氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC，美国Sigma公司)；10%水合氯醛(河北医科大学第一医院中心实验室)；10%福尔马林溶液(河北医科大学第一医院中心实验室)；总蛋白提取(radio immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液(河北医科大学第一医院中心实验室自行配制)；抑肽酶(河北医科大学第一医院中心实验室提供)；匹伐他汀片剂(2 mg/片，日本兴和株式会社)。主要仪器：ECG-9620P三道自动分析心电图机(上海光电医用电子仪器有限公司)；HX-3实验用人工呼吸机(正达实验仪器开发公司)；手术器械、7/0Prolene线(河北医科大学第一医院手术室)；颗粒制冰机(青岛阿伊斯曼公司)；电子天平(德国Sartorius AG公司)；SBHW-Ⅳ电热恒温水浴箱(北京市医疗设备厂)；LDZ5-2型低速自动平衡离心机(北京医用离心机厂)；Centrifuge 5417R低温离心机(德国制造)；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机(宁波新芝科器研究所)；-80 ℃冰箱(日本三洋公司)；-20 ℃冰箱(青岛伊莱克斯有限公司)；UNICEL DXC800全自动生化分析仪(德国BECKMAN COULTER公司)；722型分光光度计(上海第三分析仪器厂)。

1.3方法参照文献[2-3]的方法制作模型。经10%水合氯醛以3 mL/kg腹腔注射麻醉，气管插管，接人工呼吸机。以针式电极插入实验大鼠四肢皮下，尾端连接于心电图相应的肢体导联线上，以Ⅱ导联记录，记录正常心电图(纸速100 mm/s,电压20 mm/mV)作为对照。开胸，使左心耳与肺动脉圆锥之间的心大静脉清晰可见，以此静脉为标志，结扎LAD。先在结扎线下放1根1 mm的乳胶管，结扎过程中观察心肌颜色变化，结扎LAD造成左心室前壁心肌缺血30 min，然后松线再灌注120 min。模型制作成功标准：以结扎LAD后左心室前壁局部心肌立刻由鲜红变深、发绀，心电图显示ST段弓背向上抬高≥0.2 mV，T波电压进行性增高，或QRS波幅升高及时限增宽作为结扎成功标准；松开结扎线恢复冠状动脉血流，以缺血部位心肌颜色恢复，T波迅速回落、ST段骤降50%以上作为LAD成功再通标准。

1.4观测指标①大鼠实验前后心电图变化；②各组随机抽取7只大鼠用于心肌梗死面积的测定，于实验结束时间点再次原位结扎LAD，左心室内注射5%伊文思蓝溶液1 mL，确定缺血区(无蓝色)和非缺血区(蓝色)，待大鼠口唇蓝紫后迅速取左心室，垂直心室长轴切除心尖端3 mm厚心肌，其余心肌组织置-20 ℃冰箱冷冻30 min，然后自心尖向心底部垂直心室长轴切成厚2 mm切片4~5片，置1% TTC溶液中，在37 ℃恒温水浴箱中避光孵浴10~15 min以区分缺血区及梗死区，以10%福尔马林溶液固定24 h以增强染色颜色对比。以朝向心尖部的切面作为面积分析切面，蓝色为正常心肌，浅红色为缺血心肌，灰白色为梗死心肌，通过计算机分析软件测定梗死区面积(area of necrosis，AN)，以心脏总梗死区面积占总危险区面积(area at risk，AAR，即缺血区与梗死区面积之和)的百分比(AN/AAR)表示梗死面积，以危险区面积占左心室面积(left ventricle，LV)的百分比(AAR/LV)表示危险区面积。其余7只大鼠留取血液及心肌组织样本：于实验结束时间点迅速开腹，下腔静脉取血2 mL加入促凝管,室温静置并离心后，吸取上层血清，-20 ℃冰箱中保存，采用UNICEL DXC800全自动生化分析仪测定CK-MB含量；取血成功后立即垂直心室长轴切取结扎线以下所有心肌组织，液氮速冻后称质量，于-80 ℃冰箱中保存，以黄嘌呤氧化酶法测总超氧化物岐化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性。

2结果

2.1心电图变化结扎LAD前大鼠Ⅱ导联心电图显示心律规整，无ST-T、QRS波的改变；成功结扎大鼠LAD后，心电图出现QRS波群增宽，ST段迅速弓背向上抬高≥0.2 mV或伴T波抬高，还可出现病理性Q波或原有q波加深；恢复灌流时出现T波快速回落、ST段下降50%以上，再灌注时期还有如房室传导阻滞、室性心动过速、心室颤动等再灌注心律失常发生。

2.2T-SOD含量和血清CR-MB水平比较与Sham组相比，IR组、Statin组心肌T-SOD含量显著下降(P<0.01)，Statin组T-SOD含量较IR组升高，但未到Sham组水平(P<0.01)；与Sham组比较，IR组、Statin组血清CK-MB水平显著升高(P<0.01)，但Statin组血清CK-MB水平低于IR组(P<0.01)。见表1。

表1　3组T-SOD含量及CK-MB水平比较 Table 1　T-SOD,CK-MB comparison among three groups

*P<0.01与Sham组比较#P<0.01与IR组比较(q检验)

2.3心肌梗死面积比较IR组、Statin组AAR/LV 差异无统计学意义(P>0.05)，即各组心肌缺血危险程度相似，与IR组相比，Statin组AN/AAR明显减少(P<0.01)。见表2。

表2　2组心肌梗死面积比较Table 2　Myocardial infarction area comparison between two groups

3讨论

目前MIRI的机制尚未完全明确，主要观点认为能量代谢障碍是其发生的基础，在MIRI过程中自由基、钙超载、细胞凋亡、能量代谢障碍、细胞因子、血管内皮细胞损伤及中性粒细胞浸润等起重要作用。他汀类药物除有效降低胆固醇外，还具有独立于降脂作用以外其他有益的作用，具有多途径心脏保护作用。他汀的非降脂作用包括改善血管内皮功能[4]、抗炎[5]、抗氧化应激[6]、抗血小板聚集和抑制血栓形成[7]、抑制心脏电生理重构、调节心脏自主神经功能[8]等。最近研究[9]还发现他汀类药物能有效减轻MIRI。MIRI时氧自由基(oxygen free radical,OFR)的暴发是其重要的发病机制之一[10]。OFR是一类重要的细胞应激原，性质极不稳定，可造成生物膜结构破坏，细胞核分子变性等不良后果。正常情况下，体内过多的OFR可不断被抗氧化系统及时消除，机体随时处于氧化-抗氧化的平衡状态中。当组织细胞发生缺血、缺氧时，OFR清除功能降低或丧失，生成系统活跃，一旦再次恢复组织血流和氧的供给时，OFR便瞬间大量产生，并在体内急剧堆积，此时机体就处于氧化应激状态。OFR通过攻击组织内皮细胞膜脂质中的不饱和脂肪酸，使膜的结构和功能改变，膜流动性降低，通透性增加等；还可使Ca2+通道通透性增加，导致细胞内Ca2+超载，介导炎性物质产生，造成整个细胞结构与功能的损伤。OFR增加还直接抑制一氧化氮生成，导致血管内皮损伤，触发细胞凋亡[11]。

人体内存在完整的抗氧化系统来保持机体氧化-抗氧化平衡，其中SOD是最重要的抗氧化酶之一。SOD存在于细胞线粒体内，通过歧化作用使氧离子进一步转化为水和氧气，使机体维持正常生理功能，免受OFR损害。SOD 的活性可间接反映机体清除自由基和抗氧化损伤的能力[12]。SOD清除OFR的能力是有限的，如果过氧化物质产生过多，超过SOD的清除能力，就会使机体遭受OFR的氧化损伤[13]。本研究成功建立大鼠IR模型，定量检测T-SOD含量，根据T-SOD可间接反映机体清除OFR的能力来评价匹伐他汀是否能使OFR清除增多，细胞受损程度减轻。

本研究结果显示,Staitin组较IR组CK-MB水平显著下降，心肌梗死面积减少，T-SOD下降程度减轻。说明Staitin组大鼠较单纯IR组机体的抗氧化能力相对增强，可提高缺血再灌注后机体清除OFR的能力，保护心功能。表明匹伐他汀可明显提高机体的抗氧化能力，且降低了心肌受损程度，提示其抗氧化应激作用是减轻MIRI机制之一。

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(本文编辑：赵丽洁)

[收稿日期]2014-05-26；[修回日期]2014-06-24

[基金项目]河北省科学技术研究与发展计划项目(112761155)

[作者简介]尤杨(1980-)，女，河北无极人，河北医科大学第一医院主治医师，医学硕士，从事心血管疾病诊治研究。

*通讯作者

[中图分类号]R542.2

[文献标志码]A

[文章编号]1007-3205(2015)04-0373-04

[摘要]目的探讨匹伐他汀对大鼠急性心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)的保护作用，为他汀类药物在缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)心肌的临床应用提供理论依据。方法将成年雄性SD大鼠42只随机分为假手术组(Sham组)、IR组及实验组(Statin组)各14只。Sham组与IR组术前给予生理盐水2 mL/d灌胃4周，Statin组给予匹伐他汀0.42 mg·kg-1·d-1，溶解成2 mL灌胃4周。制作大鼠心肌IR模型：Sham组冠状动脉下只穿线，不结扎；IR组、Statin组结扎冠状动脉左前降支30 min，再松解120 min。术后检测血清中肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme-MB,CK-MB)水平，留取结扎线下部分心肌组织用黄嘌呤氧化酶法测心肌总超氧化物岐化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性，用氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC)、伊文思蓝双染色法测定各实验组心肌梗死面积及缺血区面积。结果与Sham组相比，IR组、Statin组的血清CK-MB升高，T-SOD含量下降(P<0.01)；Statin组CK-MB升高程度不及IR组(P<0.01)，T-SOD含量下降程度不及IR组(P<0.01)。IR组和Statin组危险区面积差异无统计学意义(P>0.05)；与IR组相比，Statin组梗死面积明显减小(P<0.01)。结论匹伐他汀可以提高机体抗氧化能力，减轻再灌注后心肌坏死程度，减轻MIRI。

Effects of pitavastatin on role of oxidative stress in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion

YOU Yang1,FENG Qian2,XIA Yue1*,QI Guo-qing1,ZHANG Yan1，ZHANG Qing-wen1

(1.Department of Cardiovascular Medicine Ⅲ,the First Hospital of Hebei Medical University,

Shijiazhuang 050031,China；2.Department of Cardiovascular Medicine Ⅲ, the First Hospital of

Zhangjiakou City,Hebei Province，Zhangjiakou 075000, China)

[Abstract]ObjectiveTo explore the effects of pitavastain on the role of oxidative stress in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion,which will provide a theoretical basis for pitavastain clinical application in myocardial ischemia-reperfusion.MethodsA total of 42 male SD rats were randomly assigned to three groups:Sham group, control group(IR group) and experimental group(Statin group).In Sham group and control group,2 mL saline was irrigated into stomach daily for four weeks, 0.42 mg/kg pitavastain dissolved in 2 mL saline was given in experimental group. In surgery, we wore line under the coronary artery without ligation in Sham group, and ligated the line for 30 minutes and then released it for 2 hours in IR group and Statin group.The levels of CK-MB were discerned after operation. Some myocardium tissue specimens under the line for ligation were used to detect the activity of total superoxide dismutase(T-SOD).The myocardial infarction size and risk area of each group were analyzed through comparing the differentiation of myocardium tissue stained by triphenyl tetrazolium chloride(TTC) and Evans blue by computer software system.ResultsThe levels of CK-MB elevated and T-SOD content decreased significantly in control group and experimental group as compared with Sham group(P<0.01).In IR group,the level of CK-MB was significantly higher than that of statin group,but lower when comes to T-SOD content(P<0.01).There were no statistical significance between statin group and IR group compared with area at risk(P>0.05). Statin group significantly reduced infarct size compared with IR group(P<0.01) .ConclusionPitavastatin could increase antioxidant capacity and it took a positive role in ischemia-reperfusion myocardial injury prevention.

[Key words]myocardial reperfusion injury；pitavastain；oxidative stress